白色假丝酵母的活性代谢物

背景^[1][2]

白假丝酵母是一种人类常见条件致病真菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，在人体抵抗力下降时会引起感染甚至危及生命。近年来，深部真菌感染日益成为医院内主要感染，其中白假丝酵母成为假丝酵母感染中最常见的病原。白假丝酵母是一种具有多种形态的真菌，形态有厚膜孢子、酵母、假菌丝、菌丝等。其中菌丝相与酵母相的转化被认为是影响致病的重要因素。已有许多研究证实，不产生菌丝相的基因缺陷型白假丝酵母在动物模型中致病性降低，而酵母相的白假丝酵母则有助于播散性感染。

生物被膜是由酵母细胞、菌丝和细胞外多聚基质 3部分组成 的一种结构群体。在白假丝酵母，生物被膜的形成会使其对一些临床常用抗真菌感染药物产生高度耐药性。因此，白假酵母的形态 变化对其在宿主环境下的生存、致病及耐药性有很大意义。在白假丝酵母形态转化过程中，能发向细胞外释放一些特定信号分子，调节微生物的密度变化，这类小分子物质称为群体感应分子(quorum sensingmolecule)。

目前白假丝酵母中已确 定的群体感应分子有法尼醇 (farneso1)、酪醇 (tyroso1)和麝油酸 (farnesoic acid)。此外，不同形态的白假酵母对氨基酸的摄取不完全相同，甚至存在很大差异。在宿主中生存时，受大量外界环境的影响，如宿主的免疫系统、渗透性、温度、pH 值、氧化水平、养分有效性、氧化还原态等，白假丝酵母会发生很大变化，承受极大的外界压力。处于逆境中的白假丝酵会于数分钟内在基和代谢水平上作出适 当反应，最终使细胞获得对逆境的抗性。

这些对外界 环境产生的应激性使白假 丝酵母快速适应外界环境，对其耐药性的产生起一定作用。当处于对数生长期 的白假丝酵 面临高温、NaCI、H2O2、CuSO4、高浓度乙醇、弱有机酸 (山梨酸酯 和苯甲酸)等胁迫时，会不同程度引起细胞内海藻糖 (trehalose)浓度上升；受高渗和柠檬酸影响时会积累大量甘油 (glycero1)；受高温和氧化应激时会生成大量阿拉伯糖醇 (D—arabito1)，这些化合物都对白假丝酵母的生物大分子有一定的保护作用。

活性代谢物^[1]

1. 胞外活性代谢物

白假丝酵母在生长过程中，会产生一些有机化合物，分泌至胞外，其中部分为群体感应分子。对这类化合物的提取和分离主要是收集培养上清液，再对培养上清液进行一系列处理，然后供分析。

1）法尼醇

法尼醇是第 1个被发现的白假丝酵母生长过程中分泌的胞外群体感应分子。有文献报道，它能影响白假丝酵母的双相性和被膜生长，抑制芽管形成，抑制酵母向菌丝转，抑制被膜形成；同时也会增强由 H2O 等引起的氧化性应激下白假丝酵 的存活率，是目前发现的白假丝酵母中作用最强、研究最多 的群体感应分子。

法尼醇是挥发性的萜类化合物，因此常用气相色谱-质谱 (GC．MS)进行检测。将收集 的含法尼醇的培养上清液进行过滤后直接进样，或采用乙酸乙酯液液萃取，进一步提纯其中脂溶性有效成分， 并分别采用 RP-HPLC-MS)、衍化 GCMS、薄层谱法对法尼醇进行鉴定。

2）麝油酸

麝油酸能抑制酵母向菌丝转化。与法尼醇相比，麝油酸的分泌有局限性，仅能在特定菌株中表达，且作用相对较弱，仅为法尼醇的 3％。高浓度麝油酸可抑制白假丝酵母菌丝生长，但不抑制酵母生长。相对法尼醇，麝油酸酵母向菌丝形 态转化的选择性 更强将培养上清液冻干，用甲醇复溶，离心后取上清液；再用旋转蒸发仪将甲醇溶液挥干，用己烷复溶；正相高效液相色谱 (NP—HPLC) 进行分离，收集流出的有效成分；挥干，用 0．1ml的 90％乙腈复溶，RP—HPLC进行梯度洗脱，获得麝油酸单体；并用 GC．MS和核磁共振波谱 (NMR)进行结构鉴定。

3）酪醇

酪醇的分泌会促进菌丝生长，从而缩短转化时间。在利于菌丝生长的条件下，酪 醇还会缩短细胞发展成芽管的时间，促进芽管形成，该作用在被膜生长的早期和中期最为显著。固相萃取、富集白假丝酵母培养液后，用 RP．HPLC纯化、制备酪醇，并对其结构进行 NMR鉴定。

4）苯乙醇和色醇

有报道，苯乙醇和色醇在白假丝酵母中起抑制菌丝形成和细胞生长的作用，但这 2个化合物对白假丝酵母形态的影响机制尚不明确，但要达到 500 mol／L才能抑制丝化现象，所以其在正常浓度范围内抑制菌丝的作用有待进一步研究。

5）MARS

在白假丝酵母研究中发现了一种物质并命名为 MARS，它能耐高温，70℃下 放置 30min还能保持稳定，但在分离 48h后或 pH 超出 4～9．5时，就会失去抑制丝化的活性。不仅白 假丝酵母可分泌 MARS，热带假丝酵母也可分泌。将含 MARS的组分用吡啶或乙醚萃取后，经RP—HPLC进一步纯化、收集。经鉴定， MARS有 1个含氮杂环结构，能抑制假丝酵母中氨基酸摄取。但 MARS分子结构及其在调节白假丝酵母形态转化中的作用仍需深入研究。

2. 胞内代谢物

白假丝酵母代谢产生用于合成蛋白质、核酸、类脂和多糖等 的一些小分子物质，如氨基酸、核苷酸、机酸和单糖衍生物等，与微生物细胞内生物合成息息相关。要对这类物质进行分析，首先要进行细胞破碎，目前主要方法有化学试剂裂解、低渗溶液胀破、反复冻融和机械性方法，将细胞破碎后才能对胞内代谢物进行下一步研究。

1）氨基酸类

氨基酸对白假丝酵母形态转化起一定作用。有文献报道，血清和氨基酸都是已知的能诱导白假丝酵母发生形态转化的物质，但其分子机制仍 不明确。氨基酸种类或数量不足也会刺激白假丝酵母的形态变化。

白假丝酵母的 2种形态对各种氨基酸的摄取需求也不完全相同，甚至存在很大差异。早期，对白假丝酵母中氨基酸的分析方法主要是往培养基中加入放射性核素标记的氨基 酸，待菌体收集、洗涤 完全后，吹干，转移到闪烁瓶中，用液体闪烁计数器计数。近年来，色谱技术广泛运用于氨基酸的分析。

2）海藻糖

海藻糖是化学性质稳定的非还原性二糖，南 2个吡喃分 子通 过糖苷键连接而成。它是细胞中的一种应激代谢物，当细胞处于长时间饥饿、高渗、热激以及孢子萌发时，海藻糖含会发生显著变化，恢复正常环境后又迅速降解。因此，海藻糖含量的变化从某种程度上反映了机体对外界环境的响应，在对不同胁迫应答中，海藻糖的积累被认为起关键作用。

3）甘油和阿拉伯糖醇

白假丝酵母在生长过程会积累大量甘油和 D-阿拉伯糖醇，造成哺乳动物感染。在培养 6h后能产生量的甘油，在 12h产生量的 D-阿拉伯糖醇和核糖醇。这些多元醇的释放与胞外环境有关。将细胞处理后，用甲基硅醚衍生化，以甲基甘露苷作为内标，通过 GC定量测定 D-阿拉伯糖醇。

采用热乙醇将细胞破碎，过滤取上清液，有效成分经甲基硅烷衍生化后进行 GC分析。该法可同时测定甘油、核醇、阿拉伯糖醇和海藻糖，但未能将核糖醇和阿拉伯糖醇分开，且甘油出峰时间较靠前，可能被衍生化试剂的峰掩盖。

致病性^[2]

白念珠菌是一种机会性致病真菌，通常存在于 人的皮肤、口腔、上呼吸道、肠道和阴道黏膜，当机体菌群失调或抵抗力降低时，可引起各种念珠菌病，甚 至血流感染。

基因分型方法^[2]

分子分型是分析机会性病真菌种群结构和流行性的重要方法，能有效鉴定 社区或医院内感染、追踪传染源、分析暴发流行、研究种群动力学、区分多重感染和评估微进化。

白念珠菌基因分型的方法主要有：脉冲场凝胶电泳 (pulsedfieldgelelectrophoresis，PFGE)、限制性片段长度多态性 (restriction fragmentlength polymorphism，RFLP)分析、随机扩增多态性 DNA (random amplifiedpolymorphicDNA，RAPD)分析、扩增片段长度多态性 (amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)分析、重复序列聚合酶链反应 (polymerase chain yeaction，PCR)、 DNA指纹分析、基因芯片 (DNA 芯片)、转录间隔区(internaltranscribedspacer，ITS)核 酸序列定、微卫星多态性分析、单核苷酸多态 性(singlenucleotidepolymorphismS，NP)析、单链构象多态性 (singlestrandconformation polymorphism，SSCP)分析与异源双链 (heteroduple)分析、多位点序列分型 (multilocussequencetyping，MLST)等。

主要参考资料

[1] 王慧, 曹颖瑛, 李燕, 等. 白假丝酵母活性代谢物种类及分离技术的研究进展[J]. 微生物与感染, 2011, 6(2): 108-112.

[2] 张金凤, & 郭大文. (2015). 白假丝酵母基因分型研究进展. 微生物与感染, 10(6), 390-394.