甘草苷的制备方法

背景及概述^[1]

甘草苷(Liquiritin)，是异甘草苷的同分异构体，白色结晶，分子式:C21H22O9，分子量:418.39，可溶于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等有机溶剂，熔点：212℃～213℃。现代研究表明，甘草苷有抗氧化、抗溃疡、治疗抑郁性精神病、艾滋病、辅助治疗糖尿病等功效。甘草为豆科植物甘草属乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralensisFisch．)、胀果甘草(G．inflataBata1．)、光果甘草(G．glabraL．)的干燥根及根茎HJ，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药之功效。甘草中黄酮类成分具有多种生物活性，除了消炎、抗菌、抗变态等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、防肿瘤等也有明显的作用。现代药理研究表明甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素为甘草黄酮类的主要有效成分。

制备^[1-4]

报道一、

从甘草中提取甘草苷的方法，包括如下步骤：

（1）将甘草粉碎成60目粉末，在90℃，料液质量比为1：5的条件下，用去离子水提取120分钟，四层纱布过滤，得甘草苷粗提液；

（2）将甘草苷粗提液,上混合树脂柱，混合树脂由质量比为2：8的聚酰胺树脂30-60目与大孔树脂HPD-100组成，用5倍柱体积的去离子水、4倍柱体积的体积百分浓度为20%乙醇水溶液、4倍柱体积的体积百分浓度为50%乙醇水溶液进行洗脱，收集体积百分浓度为50%乙醇水溶液洗脱液，减压浓缩至糖度30%，加入等体积的去离子水，搅匀，在20℃条件下析晶8小时，吸去上清液，结晶加入4倍体积的无水乙醇溶解，减压浓缩至糖度30%，加入等体积的去离子水，搅匀，在20℃条件下析晶8小时，过滤，结晶以去离子水洗至无醇味,在60℃条件下减压干燥，即得到纯化后的甘草苷。甘草苷含量为91.2%。

报道二、

取甘草酸粉50Kg，加入0.5％的稀氨水200L于60℃下保温提取2小时，过滤，滤液分别加100L的正丁醇萃取2次，上层萃取液于80℃下减压浓缩得甘草总黄酮浸膏6.12Kg；

取上述甘草总黄酮浸膏6.12Kg，加入61.2L的水，搅拌，溶解，过滤，滤液上100～200目的聚酰胺柱，上柱完成后，先用124L水洗脱去除大极性杂质，再用20％的稀乙醇124L洗脱，收集洗脱液并于80℃下减压浓缩至12.4L，过滤，滤液在8℃下放置结晶24小时，过滤，得甘草苷粗品521g；取上述甘草苷粗品521g，加入2L无水乙醇、在78℃下溶解，过滤，滤液在8℃放置结晶24小时，过滤，干燥，得甘草苷435g；

经HPLC测定，本批甘草苷含量为94.7％。

报道三、

将甘草原药材粉碎，定量称取1千克，置于50升提取罐中，加入10升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入10升水煎煮2小时，过滤，滤液与次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩，得到240毫升至相对密度为1.12的浸膏。在浸膏中加入412毫升95％乙醇，充分搅拌，0℃冷藏静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至160毫升，相对密度1.05，在浓缩液中加入854毫升95％乙醇，充分搅拌，0℃冷藏静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到甘草醇沉组分250毫升。

将甘草醇沉组分加入到截留分子量3000Da中空纤维膜分离仪的进料罐中，调整操作压力为0.1MPa，收集透过液，截留液弃去。使透过液浓度为30克/升。

大孔吸附树脂柱长80厘米，柱内径10厘米，树脂填料为0.3-1.25毫米的X-5型大孔吸附树脂，上样速度为1BV/h，分别用水和40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱部位，40％乙醇洗脱部位旋转蒸发浓缩至浓度为0.4克/毫升，过0.22微米滤膜，得到甘草树脂分离组分30毫升。

工业色谱制备：工业色谱系统依次由高压二元梯度泵、高压进样阀、色谱柱、紫外检测器、色谱工作站组成。工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为254nm，设定洗脱梯度，初始流动相(20％甲醇-水)平衡色谱柱20分钟，取甘草树脂分离样品10ml，进样，按设定梯度洗脱，收集24分至27分5秒组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分。共进样三次，将三次收集得到的洗脱组分，合并，旋转蒸发浓缩至10毫升，再通过冷冻干燥得到甘草苷产品2.0克，将样品进行高效液相分析确定产品纯度大于98％，取20毫克样品进行核磁分析，对结构进行鉴定。核磁数据：1HNMR400MHz(DMSO-d6)δ(ppm)：10.599(1H，s，OH)，7.65(1H，d，H-5)，7.45(2H，d，H-2′，6′)，7.06(2H，d，H-3′，5′)，6.51(1H，dd，H-6)，6.35(1H，d，H-8)，5.53(1H，dd，H-2)，4.89(1H，d，Glc-H-1)，3.1～3.7(m，糖上质子及transH-3)，2.67(1H，dd，cisH-3)。13CNMR400MHz(DMSO-d6)δ(ppm)：78.64(C-2)，43.16(C-3)，189.99(C-4)，128.39(C-5)，110.55(C-6)，164.62(C-7)，102.58(C-8)，163.03(C-9)，113.55(C-10)，132.35(C-1′)，127.97(C-2′，C-6′)，116.17(C-3′，C-5′)，157.44(C-4′)，100.30(Glc-C-1)，73.20(Glc-C-2)，77.03(Glc-C-3)，69.71(Glc-C-4)，76.61(Glc-C-5)，60.69(Glc-C-6)。

报道四、

（1）提取：取甘草粉末0.5kg，加入体积分数为85％的甲醇5L，经加热回流提取2h，过滤，滤渣中再加入85％的甲醇5L，加热回流2h，过滤，合并两次提取液，提取液压浓缩回收有机溶剂，残液中加入水，充分混匀，使其残液浓度为10g/L，即得中间产物A。

（2）树脂柱一次分离纯化：中间产物A以流速为3BV/h的速度通过装填有按常规方法处理后的3级串联的D101树脂柱，动态吸附至穿透，其中每级D101树脂柱的径高比为1:10；树脂柱用流速为8BV/h的水洗脱除去水溶性杂质，弃去水解析液；用60％的乙醇对洗杂后的串联树脂柱进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，将所收集的流出液减压浓缩回收有机溶剂，残液中加入适量水，使其浓度为10g/L，即得中间产物B。

（3）树脂柱的二次分离纯化：中间产物B以流速为3BV/h的速度通过3级串联的AB‑8大孔吸附树脂柱进行二次吸附，动态吸附至穿透，其中每级AB‑8树脂柱的径高比为1:6；树脂柱用流速为6BV/h的水洗脱除去水溶性杂质，弃去水解析液；再用流速为6BV/h的50％的乙醇对串联树脂柱进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，将所收集得流出液过滤后减压浓缩得到浸膏，即得中间产物C。

（4）中压梯度洗脱系统分离：中间产物C用30％的甲醇溶解，中压梯度洗脱系统进一步分离，具体为以粒径为15‑40μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，色谱柱规格为60mm×400mm，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱，分3次进样，甘草苷芹糖每次收集出峰时间为26‑28min的色谱峰，甘草苷收集出峰时间为29‑31min的色谱峰，合并3次洗脱组分，减压浓缩回收有机溶剂，冷冻干燥分别得到甘草苷芹糖0.52g，甘草苷0.71g。经高效液相色谱分析，甘草苷芹糖的纯度为94.8％，甘草苷纯度为96.4％。

参考文献

[1][中国发明]CN201110287907.7从甘草中提取甘草苷的方法

[2][中国发明]CN201010579521.9甘草苷及其制备方法

[3][中国发明,中国发明授权]CN200710011041.0一种甘草苷的分离制备方法

[4][中国发明,中国发明授权]CN201210424134.7从甘草中同步分离甘草苷和甘草苷芹糖的方法