胸腺五肽的制备方法

背景及概述^[1]

胸腺五肽简称TP5，其英文名为Thymopentin，多肽化学组成为N-精氨酰-赖氨酰-天门冬氨酰-酪氨酸，是非常重要的免疫促进类活性多肽药物，能够显著提高人的免疫力，帮助人类有效的抵抗多种疾病，同时对多种疾病都有显著而确切的疗效，市场前景广阔，具有很好的经济和社会效益。

制备^[1]

步骤1二肽化合物2{Boc-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Me}的合成

把1.69克的Boc-Val溶解于20毫升的四氢呋喃中，加入1.0毫升的N-甲基吗啉，在-10～-15℃条件下向其中加入0.75毫升的氯甲酸乙酯，加样完毕后，使反应在同样温度下反应5～6分钟之后，将1.93克酪氨酸苄醚甲酯盐酸盐的DMF溶液5毫升在-15～0℃加入反应瓶内，再向其中加入1.0毫升的N-甲基吗啉，加样完毕后，反应自然恢复至室温，并继续反应6小时，至反应完全。抽滤，滤出N-甲基吗啉盐酸盐，将滤液减压浓缩后，乙酸乙酯溶解，依次用5％稀盐酸、5％的碳酸氢钠和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干。粗产率大于100％，HPLC分析纯度大于90％。该二肽化合物2不必纯化可直接用于三肽的合成。

步骤2二肽化合物2{Boc-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Bn}的合成

把1.69克的Boc-Val溶解于15毫升的四氢呋喃中，加入1.0毫升的N-甲基吗啉，在-10～-15℃条件下向其中加入0.75毫升的氯甲酸乙酯，加样完毕后，使反应在同样温度下反应5～6分钟之后，将3.28克酪氨酸苄醚苄酯对甲基苯磺酸盐的DMF溶液5毫升在-10～0℃反应条件下加入反应瓶内，再向其中加入1.0毫升的N-甲基吗啉，加样完毕后，反应自然恢复至室温，并继续反应6小时，至反应完全。抽滤，将滤液减压浓缩后，乙酸乙酯溶解，依次用5％盐酸、5％碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干。粗产率大于100％，HPLC分析纯度大于90％。该二肽化合物2不必纯化可直接用于三肽的合成。

步骤3三肽化合物3{Boc-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Me}的合成。

将实施例1中合成的二肽化合物1.45克溶解于15毫升纯三氟乙酸内，室温反应15分钟后，减压浓缩至干，用二氯甲烷溶解，用冷的10％氢氧化钠稀释至PH为9.0，饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干，用四氢呋喃溶解后，放置冰箱备用。

将1.16克Boc-Asp溶解于四氢呋喃中，向其中加入0.4毫升N-甲基吗啉，反应瓶用冰盐浴冷却后，加入0.34毫升的氯甲酸乙酯，反应10分钟左右，再向反应瓶内加入上述预冷的脱Boc-保护后的二肽的四氢呋喃溶液，将反应自然恢复至室温，并继续搅拌6小时左右，用TLC和HPLC检测反应至完全结束后萃灭反应。布氏漏斗抽滤、减压浓缩并回收四氢呋喃，用乙酸乙酯溶解，依次用5％盐酸、冷的5％氢氧化钠和饱和食盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干(粗产率大于100％)，HPLC分析纯度大于90％。不经过纯化就可以直接用于合成四肽化合物。

步骤4四肽化合物4{Boc-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Me}的全合成。

将1.4克三肽化合物与15毫升三氟乙酸反应脱去Boc保护基，用10％冷的氢氧化钠洗涤有机溶剂至PH值为9.0，再用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后浓缩，再用四氢呋喃溶解并冷藏备用；

使0.92克Boc-(2-氯苄氧甲酰基)-赖氨酸在N-甲基吗啉0.24毫升催化下与0.21毫升氯甲酸乙酯-10～-15℃反应合成混合酸酐，该混合酸酐与上述脱去Boc保护基的三肽化合物于-15～0℃反应，经过常规化的后处理即得四肽化合物N-Boc-(2-氯苄氧甲酰基)-赖氨酰-(苄酯)天门冬氨酰-缬氨酰-(苄醚)酪氨酸酯；粗产率大于100％。该化合物无需进一步纯化即可直接用于合成后面的五肽化合物。

步骤5五肽化合物5{R3-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr-(OBn)OR2，R2＝Me，R3＝Boc}的合成。

将1.98克四肽化合物与15毫升三氟乙酸反应脱去Boc保护基，用10％冷的氢氧化钠洗涤有机溶剂至PH值为9，再用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后浓缩，再用四氢呋喃溶解并冷藏备用；

使0.7克Boc-(N-硝基)-精氨酸在0.26毫升N-甲基吗啉催化下与0.21毫升氯甲酸乙酯反应合成混合酸酐，该混合酸酐与前述脱去Boc保护基的四肽化合物反应，经过常规化的后处理即得五肽化合物N-Boc-(N-硝基)-精氨酰-(2-氯苄氧甲酰基)-赖氨酰-(苄酯)-天门冬氨酰-缬氨酰-(苄醚)酪氨酸酯，粗产率大于100％。

步骤6胸腺五肽TP5粗肽的合成与纯化。

把1.2克五肽化合物5{R3-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Me，R3＝Boc}溶解于20毫升甲醇中，通入预冷的HF气体(于HF气体切割装置中进行)约2小时，用氮气流吹走并减压抽除剩余的HF气体将反应物装入100毫升的圆底烧瓶中，向其中于0℃条件下加入2M的氢氧化钠2ml，恢复至室温反应1小时，HPLC检测皂化反应完全后，用5％稀盐酸调PH值为6.0左右，用乙醚50毫升萃取两次，除去脂溶性杂质后，碱压浓缩除去部分甲醇，制备性高压液相色谱纯化(C18柱，乙腈/水梯度洗脱)。冷冻干燥机冷冻干燥得TP5为白色冻干粉状固体588毫克。1HNMR(300MHz，DCCl3)δ(ppm)：0.635～0.657(m，6H，C(CH3)2)，1.241(m，2H，CH2)，1.446～1.583(m，6H，3CH2)，1.727～1.782(m，4H，2CH2)，2.608～2.652(m，2H，NCH2)，2.763～2.815(m，2H，NCH2)，2.969～3.037(m，3H，NCH，PhCH2)，3.863(t，2H，NCH，J＝9Hz)，4.161(t，1H，NCH，J＝6.6Hz)，4.402～4.585(m，3H，CH2，NCH)，4.689～4.726(m，1H，NCH)，6.642(d，2H，PhH，J＝8.4Hz)，6.955(d，2H，PhH，J＝8.4Hz)。FAB-MS：(M+1)＝680，ESI-MS：679。

参考文献

[1][中国发明,中国发明授权]CN200410002607.X混合酸酐法合成胸腺五肽的方法