凝胶阻滞分析(EMSA)试剂盒的应用

背景^[1-3]

凝胶阻滞分析(EMSA)试剂盒是一种通过Streptavidin-HRP及ECL检测试剂来实现化学发光检测Biotin标记的EMSA探针的检测试剂盒。同时本试剂盒也提供EMSA检测所需的结合缓冲液和上样缓冲液，及一些关键的相关试剂，可以实现非同位素的EMSA检测。

凝胶阻滞分析(EMSA),又名为Gel-Shi。通过EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的结合情况，从而可以研究细胞内一些转录因子的激活水平。本试剂盒提供了进行EMSA实验的探针标记、蛋白和DNA结合以及EMSA上样等的主要试剂，使EMSA实验变得简单方便。EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）中含有poly(dI-dC)等有效成分。其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。

凝胶阻滞分析(EMSA)试剂盒

实验原理：

一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。

在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

应用^[4][5]

用于OsEIL1调控OsWOX11参与水稻冠根发生的研究

研究发现外源施加乙烯可以增加不同品种野生型水稻的冠根数量,而乙烯信号抑制剂1-MCP处理抑制了水稻冠根发育;且突变乙烯信号关键组分OsEIN2和OsEIL1,使得冠根数目显著减少,且阻断了乙烯对冠根数目的促进作用;对其茎基部石蜡切片观察到osein2与oseil1冠根原基发生也较为滞后,且表现出对乙烯不敏感,表明乙烯通过其信号途径促进水稻冠根原基的发生。

WOX家族转录因子OsWOX11在水稻冠根的发育过程中发挥着重要的作用,敲除OsWOX11使得冠根数量显著低于野生型,且阻断乙烯处理的促进作用,而过表达OsWOX11则使得水稻冠根数量增加,冠根原基发生提前。乙烯处理3 h时显著促进了野生型中OsWOX11的表达,但在乙烯信号组分突变体osein2和oseil1中,OsWOX11的表达均降低,且不受乙烯调控,而其在EIN2-OX与EIL1-OX中的表达量显著升高。

凝胶阻滞迁移（EMSA）实验证明了OsEIL1可以直接结合于OsWOX11启动子上的EBS（EIL1 binding site）元件;烟草和水稻原生质体瞬时表达实验也证明了OsEIL1可以激活OsWOX11的表达。遗传分析表明,WOX11-CRS/seil1双突植株冠根发育严重受损,茎基部石蜡切片表明其冠根原基发生严重滞后,且与WOX11-CRS的表型相似度更高;WOX11-CRS/EIL1-OX植株冠根数量同样受到抑制,且其冠根原基发生与WOX11-CRS一致,这表明OsEIL1位于上游调控OsWOX11的转录,进而影响水稻冠根原基的发生。

水稻在扎根的过程中所受到的土壤阻力逐渐增大,因此用不同浓度的植物凝胶模拟逐步增大的土壤阻力,结果表明0.8%的植物凝胶中生长的幼苗相较于0.2%浓度中的幼苗冠根数量显著增加,茎基部的石蜡切片也表明了高浓度的植物凝胶使得水稻冠根原基提前发生。

q PCR检测发现增大的植物凝胶浓度能促进OsWOX1的表达,乙烯测定结果表明随着植物凝胶的浓度增加,水稻幼苗的乙烯释放量也会增加,因此我们得出结论:水稻幼苗扎根过程中增加的土壤阻力促进了乙烯的产生,乙烯通过其信号途径关键组分OsEIL1转录激活下游基因OsWOX11的表达,进而促进冠根提前发生。

参考文献

[1]Transcription factor LkWOX4 is involved in adventitious root development in Larix kaempferi[J].Hongming Wang,Yunhui Xie,Wusheng Liu,Guiyun Tao,Chao Sun,Xiaomei Sun,Shougong Zhang.Gene.2020(prep)

[2]Amplification and Adaptation in the Ethylene Signaling Pathway[J].Beenish J.Azhar,Alveena Zulfiqar,Samina N.Shakeel,G.Eric Schaller.Small Methods.2020(8)

[3]Genome-Wide Transcript Profiling Reveals an Auxin-Responsive Transcription Factor,OsAP2/ERF-40,Promoting Rice Adventitious Root Development.[J].Neogy Ananya,Garg Tushar,Kumar Anil,Dwivedi Anuj K,Singh Harshita,Singh Urminder,Singh Zeenu,Prasad Kalika,Jain Mukesh,Yadav Shri Ram.Plant&cell physiology.2019(10)

[4]OsSPL3,an SBP-Domain Protein,Regulates Crown Root Development in Rice.[J].Shao Yanlin,Zhou Hong-Zhu,Wu Yunrong,Zhang Hui,Lin Jian,Jiang Xiaoyan,He Qiuju,Zhu Jianshu,Li Yong,Yu Hao,Mao Chuanzao.The Plant cell.2019(6)

[5][1]李宇翔.OsEIL1调控OsWOX11参与水稻冠根发生的研究[D].中国农业科学院,2021.