猪胱硫醚Β合酶(CBS)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

猪胱硫醚Β合酶(CBS)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中胱硫醚β-合酶(CBS)水平。

原理：用纯化的胱硫醚β-合酶(CBS)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入胱硫醚β-合酶(CBS),再与HRP标记的胱硫醚β-合酶(CBS)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色.TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的胱硫醚β-合酶(CBS)呈正相关。

猪胱硫醚Β合酶(CBS)ELISA试剂盒

胱硫醚β合成酶(CBS)是一种细胞质中的同源四聚体，由63 KD的亚基组成，是一种磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)依赖性酶。在维生素B6的催化下，CBS能使丝氨酸与同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）合成胱硫醚。作为影响Hcy水平的一种关键酶，CBS在Hcy转变成胱硫醚的转硫酸路径中起着举足轻重的作用。

操作步骤：

1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于H2S通过干扰滋养细胞入侵及调控母胎界面TH1/TH2平衡影响早孕的相关作用机制研究

H2S通过干扰滋养细胞入侵影响早孕及其作用机制研究研究目的

1、H2S信号系统在母胎界面的表达特征2、H2S信号异常能否引起异常妊娠3、H2S信号如何影响滋养细胞的迁移及侵袭。

研究方法：1、Western blot技术,确定人绒毛滋养细胞CBS和CSE蛋白表达。通过免疫组化确认绒毛及蜕膜中CBS、CSE的表达特征。2、H2S合成与释放技术,确定人滋养细胞能够生成H2S。3、通过病毒转染技术,过表达或敲低人滋养细胞HTR8/SVneo CBS。Transwell技术用于H2S信号系统对人滋养细胞迁移及侵袭能力的影响。Western blot方法,进一步检测H2S信号系统对人滋养细胞中MMP2、VEGF表达的影响。4、通过CBS敲除小鼠模型以及药物干预内源性H2S产生,检测CBS缺失及H2S产生障碍对小鼠胚胎吸收的影响,并且进一步确认给予外源性H2S供体治疗后是否可以改善流产小鼠的胚胎吸收现象。

研究结果：1、妊娠早期的胎盘绒毛组织中均有CBS、CSE蛋白表达,相较于门诊正常流产的孕妇,URSA患者的绒毛中CBS降低,而CSE变化不明显。并且URSA组绒毛中CBS降低主要发生在细胞滋养层,而非合体滋养层。

2、在HTR8/SVneo和JEG3两种细胞系中均检测到了CBS和CSE蛋白,且能够产生内源性H2S。CBS抑制剂氨基氧乙酸（AOAA）和CSE抑制剂DL-炔丙基甘氨酸（PAG）能减少H2S的合成。

3、多种浓度外源性的H2S供体硫氢化钠（NaHS）或合成前体L-半胱氨酸（L-Cys）,均能够增强人滋养细胞迁移及侵袭,并且迁移及侵袭能力的改变对供体浓度具有依赖性。同样,内源性CBS也能增加HTR8/SVneo细胞迁移和侵袭。

4、H2S供体能够促进人滋养细胞MMP2、VEGF的表达,且对供体浓度具有一定的依赖性。CBS的过表达可引起MMP2和VEGF蛋白表达上调,而CBS的下调则相反。

5、CBS敲除小鼠显示出明显的胚胎吸收现象,同样H2S生物合成酶抑制剂AOAA或PAG也可诱发怀孕小鼠出现胚胎吸收。重要的是,使用H2S缓释供体GYY4137或NaHS的治疗可挽救AOAA处理或CBS缺失引起的小鼠胚胎丢失。

参考文献

[1]Cyclooxygenase 2 Promotes Proliferation and Invasion in Ovarian Cancer Cells via the PGE2/NF-κB Pathway[J].Xiao Zhang,Keqin Yan,Lin Deng,Jing Liang,Haiyan Liang,Dingqing Feng,Bin Ling.Cell Transplantation.2019(1_su)

[2]Development of the human placenta.[J].Turco Margherita Y,Moffett Ashley.Development（Cambridge,England）.2019(22)

[3]Parental Renovascular Hypertension-Induced Autonomic Dysfunction in Male Offspring Is Improved by Prenatal or Postnatal Treatment With Hydrogen Sulfide[J].Frontiers in Physiology.2019

[4]Human placenta and trophoblast development:key molecular mechanisms and model systems.[J].Kn?fler Martin,Haider Sandra,Saleh Leila,Pollheimer Jürgen,Gamage Teena K J B,James Joanna.Cellular and molecular life sciences:CMLS.2019(18)

[5]王班琴.H_2S通过干扰滋养细胞入侵及调控母胎界面TH1/TH2平衡影响早孕的相关作用机制研究[D].山东大学,2021.