人轮状病毒抗原(RV AG)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人轮状病毒抗原(RV AG)ELISA试剂盒用于定量检测血清、血浆及相关液体样本中人轮状病毒抗原（RV Ag）的含量。

人轮状病毒抗原(RV Ag)优质elisa试剂盒检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被样本抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的样本呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人轮状病毒抗原(RV AG)ELISA试剂盒

人轮状病毒抗原(RV Ag)ELISA试剂盒操作步骤

1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30钟。

2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。

3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架，别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。

4、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

5、洗板：弃去液体，吸水纸拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。

6、加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。

7、温育：重复4的操作。

8、洗板：重复5的操作。

9、显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，37℃避光显色15min。

10、终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。

11、测定：以空白孔调零，在终止后15钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。

12、计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。

应用^[4][5]

用于轮状病毒不同基因型间交叉反应研究

对单价和多价轮状病毒免疫原的免疫原性进行比较,评价单价免疫原引起的交叉保护作用与多价免疫原间的差异。

研究选取三种不同基因型的轮状病毒标准株：Wa（基因型为G1P）,SA11（基因型为G3P）和Gottfried（基因型为G4P）,这三株轮状病毒标准株单独作为单价轮状病毒免疫原,将这三株轮状病毒标准株按照不同的比例进行混合制备成多价轮状病毒免疫原。实验动物ICR小鼠随机分组为8个组,分别是3个单价轮状病毒免疫原组（Wa组,SA11组,Gottfried组）,3个二价轮状病毒免疫原组（Wa+SA11组,Wa+Gottfried组,SA11+Gottfried组）,1个三价轮状病毒免疫原组（Wa+SA11+Gottfried组）以及1个对照组（PBS组）,每组按照相同的总剂量免疫轮状病毒免疫原。

免疫后利用ELISA,中和试验以及IgA ELISA试剂盒等方法分别对各组血清样本中的轮状病毒特异性IgG水平,轮状病毒特异性中和抗体滴度以及血清IgA浓度进行检测与评价,从而对单价和多价轮状病毒免疫原的免疫原性进行比较分析。实验结果显示,单价轮状病毒免疫原免疫后,不同基因型之间能产生低于亲本株的血清交叉中和抗体；二价轮状病毒免疫原诱导的免疫反应要强于单价轮状病毒免疫原,但在二价轮状病毒免疫原的三种组合中,对Wa株及SA11株的免疫原性强于Gottfried株；三价轮状病毒免疫原诱导的免疫反应略高于单价轮状病毒免疫原,而略低于二价轮状病毒免疫原,其中免疫原性仍以Wa株最强,SA11次之,Gottfried较低。

通过以上实验结果得出结论,多价轮状病毒免疫原比单价轮状病毒免疫原能够诱导产生更多的血清轮状病毒特异性抗体,产生的血清IgA抗体也高于单价轮状病毒免疫原,而且,多价轮状病毒免疫原比单价轮状病毒免疫原能够诱导交叉免疫反应的速度更快。

参考文献

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[3]Efficacy of a monovalent human-bovine（116E）rotavirus vaccine in Indian children in the second year of life[J].Nita Bhandari,Temsunaro Rongsen-Chandola,Ashish Bavdekar,Jacob John,Kalpana Antony,Sunita Taneja,Nidhi Goyal,Anand Kawade,Gagandeep Kang,Sudeep Singh Rathore,Sanjay Juvekar,Jayaprakash Muliyil,Alok Arya,Hanif Shaikh,Vinod Abraham,Sudhanshu Vrati,Michael Proschan,Robert Kohberger,Georges Thiry,Roger Glass,Harry B.Greenberg,George Curlin,Krishna Mohan,G.V.J.A.Harshavardhan,Sai Prasad,T.S.Rao,John Boslego,Maharaj Kishan Bhan.Vaccine.2014

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[5]米鍇.轮状病毒不同基因型间交叉反应研究[D].北京协和医学院,2015.