人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的应用

背景^[1-3]

人脐静脉血管内皮细胞HUVEC是从脐带静脉中分离出来的原代细胞。这种细胞是研究内皮细胞的模型系统，研究相关的低氧、炎症、氧化应激、感染反应以及正常和肿瘤相关血管生成等应用。TNF-α和IFN-γ等细胞因子会诱导内皮细胞激活（一种炎性反应），并导致VCAM-1/CD106等细胞黏附分子上调，这些上调可使用荧光标记抗体和细胞成像进行定量。

人脐静脉内皮细胞（英Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）在进行血管内皮细胞实验时，通常选用的细胞模型为人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，简称HUVECs)。而不是直接采用静脉血管内皮细胞或动脉血管内皮细胞。原因是脐静脉内皮细胞具有干细胞的潜能，理论上可以传代50-60次。

人脐静脉血管内皮细胞HUVEC

细胞复苏

从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中解冻至管内残留一点冰屑。用75%酒精擦拭冻存管后，将内容物吸至一15ml无菌离心管中，逐滴加入预温至37℃的RPMI-1640培液4－5ml混匀，室温1500rpm离心10分钟弃上清。再用RPMI-1640培液4－5ml洗涤一次，离心后弃上清，加HUVEC完全培养液4－5ml备用，每支HUVEC冻存管含细胞量为5×10⁵个。

细胞接种培养

细胞接种：

（1）包被液：用去离水配制0.5%明胶溶液，过滤除菌。

（2）培养瓶包被：取2-4个T25培养瓶，每个培养瓶加2－3ml0.5%明胶溶液，摇匀使包被液布满培养瓶底面，置37℃2小时或放置过夜。

（3）接种细胞：接种前吸净包被液，按2500－5000个细胞/cm接种细胞（1支5×10个细胞可接种2-4个培养瓶），每瓶加培养液3-5ml,摇匀后置37℃5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后继续在37℃5%CO2培养箱内培养。

（4）扩大培养：一般每周更换培养液2次，至细胞长至覆盖培养面的70-80%可进行传代或冻存。

细胞冻存

调整细胞数2-5×10个/ml，按含细胞的RPMI-1640液ml数，配制等量的冻存液。冻存液中FBS占80%，DMSO占20%。例：含细胞的RPMI-1640液为8ml，应配冻存液8ml，其中FBS为6.4ml,DMSO为1.6ml，混匀。置细胞悬液于冰浴中，逐滴加入冻存液，边加边摇动。加完后用吸管吹打混匀。于冰浴中分装细胞于冻存管中，1.8ml/管，再将冻存管置于冻存盒内置-80℃冰箱，24小时后转入液氮中保存。

应用^[4][5]

用于氯氮平对高糖诱导HUVEC氧化应激损伤的影响研究

通过体外建立人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的高糖氧化应激损伤模型,分析氯氮平对高糖诱导HUVEC氧化应激损伤的影响,探讨氯氮平是否可能通过诱导血管内皮细胞氧化应激损伤,从而引起VTE的发生和发展。

方法：获取新鲜的新生儿脐带,0.1%Ⅰ型胶原酶灌注脐静脉消化分离和培养HUVEC,采用倒置相差显微镜来观察其形态及生长状况,免疫荧光法鉴定细胞,流式细胞法检测细胞纯度,CCK-8试剂盒检测不同浓度葡萄糖(5.5、10、20、30、40、50、60 mmol·L-1)分别作用24、48、72小时后HUVEC活性的变化,根据结果选取的葡萄糖浓度和作用时间作为造模条件;CCK-8试剂盒检测不同浓度氯氮平(0、250、500、1000、1500、2000、300ng·m L-1)对HUVEC活性的影响以及高糖条件下不同浓度氯氮平对HUVEC活性的影响;ELISA检测高糖条件下不同浓度氯氮平对HUVEC分泌氧化应激相关指标ROS、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）的水平的影响。

结果1.分离培养的HUVEC在倒置显微镜下贴壁生长,呈“鹅卵石”样排列。免疫荧光鉴定血管性血友病因子（v WF）表达为阳性,血小板-内皮黏附分子（CD31）流式细胞法检测细胞纯度达97.7%。

2. CCK-8检测发现HUVEC活性（OD值）随着作用时间的延长逐渐下降,差异有统计学意义（P<0.001）。在同一时间段,10 mmol·L-1葡萄糖时HUVEC活性较对照组升高,差异没有统计学意义（P>0.05）;作用24小时,20～60 mmol·L-1葡萄糖可使HUVEC活性呈浓度依赖性下降,差异有统计学意义（P<0.05）;作用48小时,40～60 mmol·L-1葡萄糖可使HUVEC活性呈浓度依赖性下降,差异有统计学意义（P<0.05）;作用72小时,各葡萄糖浓度间HUVEC活性没有明显差异（P>0.05）。成功建立了体外HUVEC的高糖（HG）损伤模型,最终选取30 mmol·L-1葡萄糖作用24小时作为造模条件进行后续实验。

3. 与对照组比较,不同浓度氯氮平孵育24小时对HUVEC活性没有明显影响（P>0.05）;与高糖组比较,不同浓度氯氮平与高糖共同孵育24小时对HUVEC活性也没有明显影响（P>0.05）。

4.HUVEC经高糖和氯氮平处理24小时后,500～3000 ng·m L-1氯氮平组ROS水平与高糖模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）;1000～2000 ng·m L-1氯氮平组MDA水平与高糖模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）;而SOD及NO水平改变差异与高糖模型组相比没有统计学意义（P>0.05）。

参考文献

[1]Current antipsychotic agent use and risk of venous thromboembolism and pulmonary embolism:a systematic review and meta-analysis of observational studies.[J].Liu Yinzhao,Xu Jun,Fang Kacey,Xu Yue,Gao Ju,Zhou Chao,Tang Xiaowei,Fang Xinyu,Chen Jiu,Xie Chunming,Zhang Fuquan,Zhang Xiangrong,Wang Congjie.Therapeutic advances in psychopharmacology.2021

[2]The relationship between plasma clozapine concentration and clinical outcome:a cross-sectional study.[J].Yada Yuji,Kitagawa Kohei,Sakamoto Shinji,Ozawa Atsushi,Nakada Akihiro,Kashiwagi Hiroko,Okahisa Yuko,Takao Soshi,Takaki Manabu,Kishi Yoshiki,Yamada Norihito.Acta psychiatrica Scandinavica.2020

[3]Ellagic acid alleviates clozapine?induced oxidative stress and mitochondrial dysfunction in cardiomyocytes.[J].Ahangari Roya,Khezri Saleh,Jahedsani Asal,Bakhshii Saba,Salimi Ahmad.Drug and chemical toxicology.2020

[4]Insulin Resistance and Oxidative Stress:In Relation to Cognitive Function and Psychopathology in Drug-Na?ve,First-Episode Drug-Free Schizophrenia[J].Tao Qi,Miao Yu,Li Huihui,Yuan Xiuxia,Huang Xufeng,Wang Yunpeng,Andreassen Ole A.,Fan Xiaoduo,Yang Yongfeng,Song Xueqin.Frontiers in Psychiatry.2020

[5]王美娟.氯氮平对高糖诱导HUVEC氧化应激损伤的影响[D].汕头大学,2021.