KMB-17人胚肺二倍体细胞的应用

背景^[1-3]

KMB-17人胚肺二倍体细胞来自于一个4周龄女性胚胎的正常肺组织，于1975年在中国医学科学院昆明医学生物学研究所建立；可作为转染宿主，用于肺损伤或分化的研究。

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM（推荐0012）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

KMB-17人胚肺二倍体细胞

二．细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4][5]

用于登革病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17中的适应性及生物学特性研究

人二倍体细胞系KMB17取自人胚胎肺组织,为医学生物学研究所自建并经卫生部批准用于甲型肝炎疫苗的大规模生产的细胞株.其安全性和细胞稳定性都得到了广泛验证。

对中缅边境采集的100份登革热病人血清样本进行编号和基本信息登记后,通过登革病毒IgM.IgG抗体检测试剂盒对血清样本进行抗体检测。经过统计和分析,在这些样本中,Ig M/Ig G阴性的样本仅占总样本数的5%,Ig M阳性/Ig G阴性的样本占总样本数的26%,而Ig G阳性的样本所占比例高达69%。样本接种C6/36细胞扩增后经血凝效价测定,无能够使新鲜鹅血红细胞凝集的样本。

由于IgM/Ig G阳性样本所占比例高达95%,要从中分离活病毒并进行基因分析十分困难。通过与广东省CDC合作,获得了Ⅰ-Ⅳ型登革病毒8个中国株,将其分别在C6/36细胞上进行毒种扩增和滴度测定后,以卫生部公布的登革病毒通用引物及Ⅰ～Ⅳ型登革病毒型特异性引物通过RT-PCR法进行型别鉴定。经鉴定的毒株以4.0MOI在人胚肺二倍体细胞KMB17上反复传代,直至登革病毒能在KMB17细胞中引起显著病变,然后进行培养条件优化,确定其感染条件。

将病变毒株在KMB17细胞中连续传代10代,选育出良好的细胞适应株,并经过三轮噬斑纯化。微量滴定法检测1-10代病毒的感染性滴度,免疫荧光法检测病毒纯化株的抗原性,实时荧光定量法进行增殖动力学研究。病毒培养液经蔗糖梯度离心和超速离心纯化后,电镜检测病毒颗粒形态。

结果显示,将Ⅰ～Ⅳ型登革病毒中国株提取RNA进行RT-PCR,能分别扩增出511bp的登革病毒特异性基因和482bp、119bp、290bp和392bp的型特异性基因；毒株接种C6/36细胞收获扩增的病毒液,将此病毒液感染KMB17细胞并经过反复传代后,可使KMB17产生明显的细胞病变（CPE）；将病毒适应株在KMB17细胞上进行10代连续传代培养,细胞病变速度逐渐增快,至第10代达到增殖高峰。

分别经三轮噬斑纯化后筛选出四型纯化毒株,免疫荧光法检测感染KMB17细胞的纯化株病毒的抗原性,结果均呈阳性,病毒经纯化后电镜下显示形态正常增殖动力学研究显示,登革病毒适应株在KMB17细胞中接种后第3天已经开始增殖,在第5-6天增殖最为迅速,在第7天病毒增殖达到最高峰。

参考文献

[1]The development of a novel serotyping-NS1-ELISA to identify serotypes of dengue virus[J].Chunya Puttikhunt,Tanapan Prommool,Nathaporn U-thainual,Prapapun Ong-ajchaowlerd,Kroong Yoosook,Chutithorn Tawilert,Thaneeya Duangchinda,Aroonroong Jairangsri,Nattaya Tangthawornchaikul,Prida Malasit,Watchara Kasinrerk.Journal of Clinical Virology.2011(4)

[2]The development of recombinant subunit envelope-based vaccines to protect against dengue virus induced disease[J].Beth-Ann G.Coller,David E.Clements,Andrew J.Bett,Sangeetha L.Sagar,Jan H.Ter Meulen.Vaccine.2011(42)

[3]Antibody-dependent enhancement of dengue virus infection in vitro by undiluted sera from monkeys infected with heterotypic dengue virus[J].Mikako Ito,Ryo-zabro Mukai,Tomohiko Takasaki,Akira Kotaki,Ichiro Kurane.Archives of Virology.2010(10)

[4]Dengue infection of monocytic cells activates ER stress pathways,but apoptosis is induced through both extrinsic and intrinsic pathways[J].Pathama Klomporn,Mingkwan Panyasrivanit,Nitwara Wikan,Duncan R.Smith.Virology.2010(2)

[5]赵玉娇.登革病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17中的适应性及生物学特性研究[D].北京协和医学院,2012.