H4细胞的应用

背景^[1-3]

H4细胞建系于1973年；它衍生于一个患神经胶质瘤的37岁病人的脑组织。H4细胞的致瘤特性己经被屏蔽，细胞接种动物一般不产生肿瘤结节。H4细胞具有修复MNNG损伤5型腺病毒的能力。

H4细胞

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

应用^[4][5]

用于CMIP在神经胶质瘤细胞中的表达和意义研究

观察C-Maf诱导蛋白（C-Maf inducing protein,CMIP）对人神经胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响,探索CMIP基因在其发挥作用中与MDM2基因的相互影响及调控关系。检测在神经胶质瘤患者病理组织中CMIP蛋白的表达情况,分析其意义。

方法:本研究主要通过体外细胞实验和临床病理实验进行验证。

1、体外细胞实验:（1）采用三种神经胶质瘤细胞（A172、U251和H4）,通过实时荧光定量PCR实验（RT-qPCR）检测CMIP的信使RNA（mRNA）在这三种神经胶质瘤细胞中的表达水平。

（2）通过对高表达CMIP的人神经胶质瘤细胞A172中用siRNA方法敲低CMIP的表达水平,在低表达CMIP的人神经胶质瘤细胞U251中通过转染CMIP过表达质粒方法提高CMIP的表达水平。利用MTT法和细胞克隆形成实验评价细胞增殖能力和细胞活力;采用流式细胞术实验检测A172细胞在转染CMIP-siRNA前后的凋亡变化;利用trsnswell小室进行细胞迁移实验和细胞侵袭实验检测。

（3）通过Western Blot实验,在神经胶质瘤细胞A172和U251中检测CMIP被敲低或过表达情况下,检测MDM2基因表达水平的变化,作为CMIP下游调控基因进一步探索。

2、CMIP表达的临床病理研究:收集99例神经胶质瘤患者肿瘤组织标本和59例正常瘤旁中枢神经组织标本,所有标本均经10%中性福尔马林液固定、石蜡包埋。这些患者除患有神经胶质瘤疾病以外未被检测出其他相关颅内疾病,在被手术切除肿瘤之前也未经历其它的治疗方案,避免了因其它疾病或治疗可能对本实验造成的干扰。同时收集这些患者详细的临床各相关参数,包括年龄、性别、KPS评分、肿瘤的恶性分级和患者治疗后的无复发生存期（RFS）及整体生存期（OS）。临床参数的收集参照国际卫生组织的神经胶质瘤分级标准,87例患者术后随访时间均超过了24月。

（1）应用免疫组织化学实验检测了CMIP在各胶质瘤肿瘤组织中的表达水平,与瘤旁正常神经胶质组织进行比较。

（2）应用免疫组织化学技术检测相同病例MDM2的表达水平,分析其与CMIP基因之间的关系。

（3）分析CMIP在神经胶质瘤组织中的表达和临床病理学参数的相关性,这些参数包括患者的年龄、性别、组织分级和KPS评分。

（4）根据神经胶质瘤组织的CMIP表达水平的高低与患者无复发存活率（recurrence free survival rate,RFS）及整体存活率（overall survival rate,OS）的关系绘制Kaplan-Meier曲线,进行相关性分析。

参考文献

[1]CMIP is oncogenic in human gastric cancer cells[J].Jianlin Zhang,Jin Huang,Xingyu Wang,Weidong Chen,Qinqing Tang,Maoyong Fang,Yeben Qian.Molecular Medicine Reports.2017(5)

[2]Overexpression of TIP30 inhibits the growth and invasion of glioma cells[J].Yingying Hu,Fengsheng Chen,Feiye Liu,Xinhui Liu,Na Huang,Xiaoli Cai,Yi Sun,Aimin Li,Rongcheng Luo.Molecular Medicine Reports.2016(1)

[3]MicroRNA-16 inhibits the proliferation,migration and invasion of gliomacells by targeting Sal-like protein 4[J].Yu Zhou,Yang Liu,Chao Hu,Yugang Jiang.International Journal of Molecular Medicine.2016(6)

[4]CXCL5 promotes the proliferation and migration of glioma cells in autocrine-and paracrine-dependent manners[J].Zhijie Dai,Jun Wu,Fenghua Chen,Quan Cheng,Mingyu Zhang,Ying Wang,Yong Guo,Tao Song.Oncology Reports.2016(6)

[5]王斌.CMIP在神经胶质瘤细胞中的表达和意义[D].安徽医科大学,2017.