MDA-MB-453人乳腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

MDA-MB-453人乳腺癌细胞是由R·Cailleau等在1976年从一位48岁女性肿瘤转移患者胸水中建立的细胞株，其它转移灶包括淋巴结、脑和胸水及心包腔积水；MDA-MB-453细胞过表达FGF受体。

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

MDA-MB-453人乳腺癌细胞

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.尽量吸干净T25瓶原培养基；

2.加3-4ml常温PBS轻轻润洗细胞10-20s，吸走润洗的PBS；

3.T25瓶加1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶以使胰酶铺匀瓶底细胞层；

4.将培养瓶放入37度培养箱消化；

5.消化到细胞间隙变大，但未完全脱落时加2-3ml完全培养基终止胰酶消化；

6.混匀细胞，900rpm离心3-5min，弃上清；

7.加新的完全培养基轻轻重悬细胞，均匀分到新的培养瓶里；

8.补足完全培养基，将培养瓶放回培养箱静置培养；

冻存细胞操作流程

1.消化并离心获得细胞沉淀后，加配置好的冻存液轻轻重悬细胞；

2.将细胞悬液尽快移入已经做好标记的冻存管；

3.将冻存管转入程序冻存盒，放入-80度冰箱过夜，第二天转入液氮保存；没有程序冻存盒的实验室，加入细胞后可以将冻存管放在泡沫盒中4度静置5-10min，再-20度静置2h后转入-80度过夜，第二天转入液氮保存

应用^[4][5]

用于ADAMTS8基因抑制乳腺癌MDA-MB-453细胞的增殖、迁移和侵袭并促进凋亡的机制研究

ADAMTS8过表达对乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究目的:探讨ADAMTS8对乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。

方法:1.Western blot技术检测乳腺癌患者的肿瘤组织及相邻的癌旁非肿瘤组织中ADAMTS8的表达水平。

2. Western blot技术检测乳腺癌MDA-MB-231,MDA-MB-468,MDA-MB-453,细胞中ADAMTS8的表达水平。

3. 设计并合成ADAMTS8过表达及对照质粒,将其转染进入MDA-MB-453细胞中;Western blot检测乳腺癌MDA-MB-453细胞中ADAMTS8的表达情况。

4. CCK-8法检测转染ADAMTS8过表达质粒对乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖的影响。

5. CCK-8法检测转染ADAMTS8过表达质粒对乳腺癌MDA-MB-453细胞化疗敏感性的影响。

6. 流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测ADAMTS8过表达对乳腺癌MDA-MB-453细胞凋亡水平的影响。

7. Western blot技术检测ADAMTS8过表达对乳腺癌MDA-MB-453细胞中P53和C-Myc蛋白表达的影响。

结果:1.Western blot检测了乳腺癌患者的肿瘤组织及相邻的癌旁非肿瘤组织中ADAMTS8的表达水平,结果显示,20例乳腺癌患者癌组织中ADAMTS8蛋白表达水平均较癌旁正常组织明显减低（P<0.05）。

2. Western blot检测了5种乳腺癌细胞株中ADAMTS8的表达水平,结果显示,相对于其他4种乳腺癌细胞珠,MDA-MB-453细胞中ADAMTS8蛋白表达水平最低,因此在后续研究中,我们使用MDA-MB-453细胞作为研究对象。

3. 成功构建ADAMTS8稳定过表达的MDA-MB-453细胞株。

4. Western blot分析证明MDA-MB-453细胞转染ADAMTS8过表达质粒后,ADAMTS8蛋白表达水平明显升高。

5. 细胞增殖实验结果显示,与对照组和空白组相比,ADAMTS8过表达的MDA-MB-453细胞增殖能力明显下降（P<0.05）。

6. 化疗敏感性实验结果显示,ADAMTS8过表达的MDA-MB-453细胞对紫杉醇的敏感性明显增强（P<0.05）。

7. 流式细胞术结果显示,与对照组和空白组相比,ADAMTS8过表达的MDA-MB-453细胞凋亡水平明显增加（P<0.05）。

8. Western blot技术检测结果显示,乳腺癌MDA-MB-453细胞中P53和C-Myc蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。

结论:1.稳定转染ADAMTS8过表达质粒能有效提高ADAMTS8表达水平。2.ADAMTS8过表达能够显著抑制MDA-MB-453细胞增殖能力,增强其对紫杉醇的敏感性,并促进MDA-MB-453细胞凋亡。3.抑制P53和C-Myc的表达水平可能是ADAMTS8调控MDA-MB-453细胞凋亡的主要机制。

参考文献

[1]The master regulators Myc and p53 cellular signaling and functions in polycystic kidney disease[J].Almira Kurbegovic,Marie Trudel.Cellular Signalling.2020(prep)

[2]MicroRNA-139-5p inhibits cell viability,migration and invasion and suppresses tumor growth by targeting HDGF in non-small cell lung cancer.[J].Zhang Zuxiong,Li Weizhi,Jiang Damei,Liu Chi,Lai Zhenghong.Oncology letters.2020(3)

[3]Hexokinase 2 dimerization and interaction with voltage-dependent anion channel promoted resistance to cell apoptosis induced by gemcitabine in pancreatic cancer.[J].Fan Kun,Fan Zhiyao,Cheng He,Huang Qiuyi,Yang Chao,Jin Kaizhou,Luo Guopei,Yu Xianjun,Liu Chen.Cancer medicine.2019(13)

[4]Inactivation of ADAMTS18 by aberrant promoter hypermethylation contribute to lung cancer progression.[J].Zhang Yan,Xu Hongying,Mu Junhao,Guo Shuliang,Ye Lin,Li Dairong,Peng Weiyan,He Xiaoqian,Xiang Tingxiu.Journal of cellular physiology.2019(5)

[5]张锟.ADAMTS8基因抑制乳腺癌MDA-MB-453细胞的增殖、迁移和侵袭并促进凋亡的机制研究[D].河北医科大学,2020.