人胚肺成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

人胚肺成纤维细胞是由H·Kuramoto于1968年分离的HEC-1-A细胞亚株。不同于HEC-A-1的是：HEC-1-B细胞在培养第135天到190天之间表现出稳定的生长周期，且重现扁平，与亲本细胞系相比更具铺路石样。此外，HEC-1-B细胞的主要染色体组是亲本细胞的两倍。

HELF(人胚肺成纤维细胞)的基本特性：

（1）组织来源于正常人肺静脉组织。

（2）鉴定：肌动蛋白，alpha-SMA和Desmin免疫荧光染色。

（3）原代细胞培养末期液氮冻存。

（4）每冻存管细胞数：500000cells/1ml。

（5）肌动蛋白，alpha-SMA和Desmin免疫荧光染色验证。

（6）不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

人胚肺成纤维细胞

细胞操作：

复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

1.接收到，用75%的酒精消毒（建议配制75%酒精的水是灭菌过的）培养瓶外部。

2.肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X各一张）。

3.严格无菌操作，打开细胞培养瓶。

4.将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒）。

5.1000rpm,5min离心，重悬细胞。换新的细胞培养瓶和新鲜培养基，37℃,5%CO2培养。

应用^[4][5]

用于P物质对人胚肺成纤维细胞作用及其机制的研究

探讨P物质（Substance P,SP）对人胚肺成纤维细胞（MRC-5）增殖与活化的作用及其调控机制,进一步揭示P物质参与肺间质纤维化中的作用机理,为临床治疗肺间质纤维化的药物研究与开发提供新的思路。

方法:体外培养人胚肺成纤维细胞（MRC-5）,取对数生长期的细胞为研究对象,展开以下研究:（1）以系列浓度（1、10、100、1000、10000 n M）的P物质处理MRC-5细胞,利用CCK8法检测系列浓度的P物质在不同时间点（24、48、72h）对MRC-5增殖活性影响。从而筛选出P物质对MRC-5细胞的作用浓度及时间。

（2）利用天狼猩红染色检测系列浓度的P物质在72h时MRC-5细胞分泌胶原纤维含量变化。

（3）使用Western blot检测系列浓度的P物质在72h时MRC-5细胞对α-SMA蛋白表达的影响。

（4）在此基础上,我们将细胞分为三个组,分别是对照组、100 n M P物质组（简称P物质组）、100 n M P物质+10μM L732138组（NK-1R抑制剂）（以下简称P物质+L732138组）,将以上三组细胞培养72h后,分别以CCK8法检测各组细胞增殖活性,用天狼猩红染色检测各组细胞分泌胶原纤维的含量变化,利用Western blot检测各组细胞α-SMA蛋白表达的变化,从而阐明P物质对MRC-5细胞的增殖及活化作用。

（5）为研究P物质对MRC-5细胞的作用机制,将对照组、P物质组、P物质+L732138组三组细胞体外培养72h,利用Western blot检测各组细胞TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白的表达变化。

（6）为进一步检测SP/NK-1R在TGF-β1/Smad3信号通路中的作用,我们再次将细胞分为三个组,分别是对照组、100 n M P物质组（简称P物质组）,100 n M P物质+10μM SB431542组（TGFβR1抑制剂）（以下简称P物质+SB431542组）,分别以CCK8法检测各组细胞增殖活性,用天狼猩红染色检测各组细胞分泌胶原纤维的含量变化。

结果:（1）MRC-5细胞经系列浓度（1、10、100、1000、10000 n M）P物质处理后,24 h后OD值无明显变化;与对照组比较,在处理48h及72h后,100n M P物质组细胞OD值均升高,其中以72h时OD值升高更为明显（P<0.01）。

（2）MRC-5细胞经系列浓度P物质处理72 h后,与对照组比较,100 n M P物质组处理的细胞胶原纤维含量明显增多（P<0.001）。

（3）经系列浓度P物质处理72 h后,与对照组比较,10 n M P物质组及100 n M P物质组细胞α-SMA蛋白相对表达水平均增高,其中以100 n M P物质组增高更为显著（P<0.001）。

参考文献

[1]Substance P and fibrotic diseases[J].Lei Peng,George O.Agogo,Jianqiang Guo,Ming Yan.Neuropeptides.2019(C)

[2]Renal fibrosis:Recent translational aspects[J].Hélène Fran?ois,Christos Chatziantoniou.Matrix Biology.2018

[3]Idiopathic pulmonary fibrosis:pathogenesis and management.[J].Sgalla Giacomo,Iovene Bruno,Calvello Mariarosaria,Ori Margherita,Varone Francesco,Richeldi Luca.Respiratory research.2018(1)

[4]Macrophage migration inhibitory factor promotes cardiac fibroblast proliferation through the Src kinase signaling pathway.[J].Xue Yu-Mei,Deng Chun-Yu,Wei Wei,Liu Fang-Zhou,Yang Hui,Liu Yang,Li Xin,Wang Zhaoyu,Kuang Su-Juan,Wu Shu-Lin,Rao Fang.Molecular medicine reports.2018(2)

[5]曾令军.P物质对人胚肺成纤维细胞作用及其机制的研究[D].西南医科大学,2021.