人骨肉瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人骨肉瘤细胞是从一名13岁的白人女性的骨肉瘤组织中分离建立的；HOS细胞表现为扁平形态、低饱和密度、软琼脂中的低克隆形成率和对化合物及病毒感染的敏感性。

人骨肉瘤细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM培养基(MEM，GIBCO)，90%；胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

用于人参皂苷Rg3抑制人骨肉瘤细胞增殖及其分子机制研究

人参皂苷Rg3的甾体结构使得它可以与细胞膜、膜结合离子通道、以及胞内和胞外的受体相互作用来改变细胞的转录水平以来发挥抗肿瘤作用。

研究方法:本实验应用MTT实验、流式细胞术、细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验检测了人参皂苷Rg3对骨肉瘤细胞系MG-63、HOS和U2OS增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响和对细胞周期作用。又进一步选择MG-63细胞作为研究对象,应用western blot、定量PCR、流式细胞术、小干扰RNA等实验手段进一步探究人参皂苷Rg3诱导细胞自噬、凋亡以及细胞周期阻滞的具体作用机制。

实验结果:MTT实验发现人参皂苷Rg3以剂量依赖的方式抑制三种骨肉瘤细胞系MG-63、HOS以及U2OS的增殖。流式细胞术则验证人参皂苷Rg3的促三种肉瘤细胞系的凋亡。

细胞划痕实验和Transwell细胞侵袭实验验证了人参皂苷Rg3可以抑制三种骨肉瘤细胞系的迁移和侵袭。WB实验发现经人参皂苷Rg3处理的的骨肉瘤细胞MG-63中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平与未加药的对照组相比有显著性地升高。Western blot和定量PCR证实人参皂苷Rg3组caspase-3的基因和蛋白表达水平增加,流式细胞术证实人参皂苷Rg3组细胞凋亡水平升高。

而当使用代表性自噬通路抑制剂3-MA和人参皂苷Rg3同时作用于MG-63细胞时,WB实验和定量PCR显示3-MA可以显著逆转由人参皂苷Rg3导致的细胞凋亡和自噬相关蛋白的转录和表达水平的变化。

而用小干扰RNA技术沉默LC3基因可以显著逆转人参皂苷Rg3导致的MG-63细胞的凋亡和迁移侵袭受限。WB实验显示人参皂苷Rg3可以使p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTORC1/mTORC1表达水平降低,而LC3/β-actin的表达水平增高,而加入PI3K激动剂IGF-1则可以逆转人参皂苷Rg3导致的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTORC1/mTORC1和LC3/β-actin表达水平的变化。

流式细胞术检验经人参皂苷Rg3处理的骨肉瘤细胞系MG-63、HOS、U2OS处于G0/G1的细胞的比例上升,处于S期的细胞比例下降。WB实验结果显示人参皂苷Rg3处理的MG-63细胞中cyclinA、cyclinB的表达未见明显改变,而cyclinD1、CDK-4以及CDK-6的表达量显著下降,上游调节因子p53、p21的表达量显著上升。

参考文献

[1]Ginsenoside Rg3 suppresses the proliferation of prostate cancer cellline PC3 through ROS?induced cell cycle arrest[J].Yanfei Peng,Ran Zhang,Xu Yang,Zhaiyi Zhang,Ning Kang,Liying Bao,Yongmei Shen,Hao Yan,Fang Zheng.Oncology Letters.2019(1)

[2]Ginsenoside Rg3 Suppresses Proliferation and Induces Apoptosis in Human Osteosarcoma[J].Yi Li,Jinying Lu,Furong Bai,Yanan Xiao,Yiran Guo,Ziming Dong,Mirella Falconi.BioMed Research International.2018

[3]Progress in the chemotherapeutic treatment of osteosarcoma（Review）[J].Ya Zhang,Jingqing Yang,Na Zhao,Cao Wang,Santosh Kamar,Yonghong Zhou,Zewei He,Jifei Yang,Bin Sun,Xiaoqian Shi,Lei Han,Zuozhang Yang.Oncology Letters.2018(5)

[4]Modulating autophagy in cancer therapy:Advancements and challenges for cancer cell death sensitization[J].Punya Bhat,Jurgen Kriel,Babu Shubha Priya,Basappa,Nanjunda Swamy Shivananju,Ben Loos.Biochemical Pharmacology.2018

[5]刘明阳.人参皂苷Rg3抑制人骨肉瘤细胞增殖及其分子机制研究[D].吉林大学,2020.