HACAT人永生化表皮细胞的应用

背景^[1-3]

HACAT人永生化表皮细胞源自一位62岁患有黑色素瘤男性的病灶外围正常皮肤，角蛋白、角化细胞交联外膜蛋白、中间丝相关蛋白阳性。

HACAT人永生化表皮细胞

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

收到2ml小管细胞，收到细胞后，用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内，严格无菌操作；将小管细胞转移至T25培养瓶或6cm培养皿，加入5ml左右完全培养基混匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞密度：若密度未超过80%，换液继续培养，视情况传代或者冻存。若密度超过80%，可直接进行传代（方法同上）。

2、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

应用^[4][5]

用于核基质蛋白在姜黄素诱导人永生化表皮HaCaT细胞凋亡过程中的变化研究

在鉴定姜黄素（curcumin,Cur）诱导人永生化表皮HaCaT细胞凋亡的基础上,应用选择性抽提整装透射电镜和蛋白质组学分析技术,对HaCaT细胞诱导凋亡过程中核基质-中间纤维系统的构型变化和核基质蛋白组成的变化进行系统研究。

分析鉴定与表皮细胞凋亡相关的特异核基质蛋白,并探索它们在表皮细胞凋亡过程中的调控作用,以期能够在较为整体的水平上进一步认识表皮细胞凋亡及其机理,从而找出表皮细胞凋亡研究的新方向。

实验结果显示,经7.5μg/mL姜黄素处理之后,人永生化表皮HaCaT细胞的增殖受到明显抑制,细胞生长抑制率达83.03%;细胞周期检测出现亚二倍体（亚G1期）细胞峰值,细胞凋亡率达13.1%,并发生G2/M期阻滞;琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡典型的DNA“梯状”条带:光镜和透射电镜观察结果显示,经姜黄素诱导处理后的HaCaT细胞出现了细胞体积缩小、核质比例减小、细胞核固缩、核内染色质凝聚、线粒体肿胀、内质网网腔扩大、出现凋亡小体等显著的凋亡特征;而且与细胞凋亡相关的癌基因bcl-2表达下调,抑癌基因p53、fas、bax等表达上调。

选择性抽提整装光镜和电镜观察显示,经姜黄素处理的HaCaT细胞的核基质和中间纤维比对照组明显稀疏,且分布更加不均匀,并分别与核纤层连系,形成趋于断裂但相对还较为完整的网状结构;双向凝胶电泳分析显示在姜黄素诱导HaCaT细胞凋亡前后存在27个差异表达的核基质蛋白,经质谱分析,鉴定了其中的21个蛋白,其中在凋亡的HaCaT细胞中表达上调的9种蛋白鉴定为:Chaperonin containing TCP1、RNA binding motif、Hypothetical proteinAt4g18230、serine proteinase inhibitor、SUMO-1-specific protease、nucleoporinNUP107、coagulation factor V precursor、Apoptosis-inducing factor、Caspase 3;表达下调的6种蛋白质为LMNA protein、Vimentin、Glycosyl transferase,family 2、Actin、MAP/microtubule affinity-regulating kinase、translation initiation factor IF-2。

诱导凋亡处理后新出现的6种蛋白质为Alcohol dehydrogenase[NADP+]、锌指蛋白ZNF483、MHC classⅠantigen、M-phase phosphoprotein-1、Heat shock 90kDaprotein、Protein kinase D3。鉴定出的21种核基质蛋白中除vimentin、actin,LMNAprotein,NUP107,HSP90,SUMO-4蛋白酶,ZNF483 protein,MHC classⅠantigen,Chaperonin containing TCP1外,其余均为首次在核基质中发现的蛋白质。

研究结果表明,7.5μg/mL姜黄素对人永生化表皮HaCaT细胞的凋亡具有显著诱导作用,在HaCaT细胞凋亡过程中不仅其核基质-中间纤维系统构型产生了明显的凋亡特征性变化,而且其核基质蛋白组成也相应发生了明显改变。

参考文献

[1]Does apoptosis‐inducing factor（AIF）have both life and death functions in cells?[J].Alan G.Porter,Alexander G.L.Urbano.Bioessays.2006(8)

[2]Protein kinase D directly phosphorylates histone deacetylase 5 via a random sequential kinetic mechanism[J].Q.Khai Huynh,Timothy A.McKinsey.Archives of Biochemistry and Biophysics.2006(2)

[3]Cleavage of p53-Vimentin Complex Enhances Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand-Mediated Apoptosis of Rheumatoid Arthritis Synovial Fibroblasts[J].Xinwen Yang,Jianhua Wang,Cunren Liu,William E.Grizzle,Shaohua Yu,Shuangqin Zhang,Stephen Barnes,William J.Koopman,John D.Mountz,Robert P.Kimberly,Huang-Ge Zhang.The American Journal of Pathology.2005(3)

[4]Induction of apoptosis in human lung cancer cells by curcumin[J].G Radhakrishna Pillai,Anand S Srivastava,Tarek I Hassanein,Dharam P Chauhan,Ewa Carrier.Cancer Letters.2004(2)

[5]杨海波.核基质蛋白在姜黄素诱导人永生化表皮HaCaT细胞凋亡过程中的变化研究[D].厦门大学,2008.