C6大鼠脑胶质瘤细胞的应用

背景^[1-3]

C6大鼠脑胶质瘤细胞是由Benda等用N-亚硝基甲脲诱导的大鼠胶质瘤克隆，并经过一系列的体外培养和动物传代交替后建成的。该细胞表达S-100；产生生长激素；糖皮质激素作用下可以产生磷酸甘油脱氢酶。当细胞从低密度生长至回合状态时，S-100产量增加10倍。

C6大鼠脑胶质瘤细胞

细胞培养步骤:

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备F12K培养基；马血清，15%；优质胎牛血清，2.5%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

用于抑胶素对大鼠C6胶质瘤细胞抑制作用的体内实验研究

研究氯通道阻滞剂抑胶素对大鼠脑胶质瘤模型的抑瘤效应及肿瘤细胞增殖活性变化。

方法：1、对C6胶质瘤细胞株进行了复苏、培养后，用GFAP免疫组化染色鉴定细胞的来源，于接种前采用MTT法测定细胞存活率达90%以上。

2、采用脑立体定向术，在Wistar大鼠脑尾状核接种C6细胞，饲养7天后，观察大鼠的生存状态，并采用病理学检查等方法证实成功地建立了动物模型。

3、在动物模型的基础上，于接种后一周随机将大鼠分为实验组（分<WP=38>为抑胶素不同药物浓度组和顺铂组）及空白对照组，给药7天后观察肿瘤体积变化，计算抑瘤率；并采用HE染色、光镜、电镜等方法，对比观察分析抑胶素及顺铂对鼠脑胶质瘤作用的形态学变化。

4、应用免疫组织化学方法检测应用抑胶素前后鼠脑胶质瘤PCNA蛋白表达，探讨其对肿瘤细胞增殖活性的影响。

结果：1、实验组大鼠有较好的生存状态,而对照组状态不佳，死亡较多，死亡率达20％。

2、抑胶素对C6鼠脑胶质瘤的生长具有明显的抑制作用。浓度为16～64ug/kg均有一定地抑瘤作用，以后两者的抑瘤作用较强，肿瘤体积较对照组明显缩小，抑瘤率分别达38.3%和54.61%，这与体外实验结果基本一致。

3、光镜下观察，对照组的瘤细胞生长活跃密集成群，向脑组织浸润生长。瘤细胞异型性明显，体积大，胞质红染，细胞核大深染，核分裂像多见，少数细胞可见核固缩、浓染。实验组Ⅰ给药后，镜下表现与对照组无明显差别；实验组Ⅱ镜下瘤细胞丰富密集，多形性明显，可见核分裂象，凋亡细胞易见，常见坏死区和出血灶，血管增生丰富；实验组Ⅲ可见瘤细胞较为稀疏，可见大量的凋亡细胞，核分裂象较少见，亦可见坏死的细胞，膜不完整，胞核很淡甚或消失，周边可见出血灶；实验组Ⅳ在光镜下可见到瘤细胞数量明显减少，肿瘤细胞坏死，胞浆溶解，仅剩核碎片堆集在一起，坏死或凋亡后的肿瘤细胞被增生的胶原纤维细胞所替代；<WP=39>顺铂组显示瘤细胞呈典型的凋亡改变。

4、透射电子显微镜观察给药前后瘤细胞的超微结构变化：对照组细胞形态不规则，突触发达，细胞表面可见微绒毛结构，细胞核亦不规整，核内异染质较多，细胞质内可见到线粒体、粗面内质网及游离核糖体等结构。抑胶素实验组及顺铂组细胞突触减少，微绒毛消失，细胞核极不规则，核固缩明显，可见细胞核有切迹，细胞质内多数线粒体肿胀、空化，线粒体嵴断裂，内质网扩张，同时有一些髓样小体出现，顺铂组瘤细胞呈典型的凋亡形态特征。

参考文献

[1]THE MITOCHONDRIAL DEATH/LIFE REGULATOR IN APOPTOSIS AND NECROSIS[J].Guido Kroemer,Bruno Dallaporta,Michele Resche-Rigon.Annual Review of Physiology.1998

[2]Human astrocytoma cells express a unique chloride current[J].Nicole Ullrich,G.Yancey Gillespie,Harald Sontheimer.NeuroReport.1996(5)

[3]Human astrocytoma cells express a unique chloride current[J].Nicole Ullrich,G.Yancey Gillespie,Harald Sontheimer.NeuroReport.1995(1)

[4]Apoptosis and cell proliferation in human neuroepithelial tumors[J].D.Schiffer,P.Cavalla,A.Migheli,A.Chiò,M.T.Giordana,S.Marino,A.Attanasio.Neuroscience Letters.1995(2)

[5]姜慧轶.抑胶素对大鼠C6胶质瘤细胞抑制作用的体内实验研究[D].吉林大学,2004.