非洲绿猴SV40转化的肾细胞的应用

背景^[1-3]

非洲绿猴SV40转化的肾细胞（COS-1）源自CV-1细胞，经带有编码野生型T抗原的起始失活突变的SV40转染得到的成纤维细胞样贴壁细胞。COS-1细胞含有一个来自SV40基因组全部早期区域的组成型拷贝，EBNA呈阴性，Fc受体呈阴性，补体受体呈阴性。培养条件：DMEM，10%FBS；空气95%，二氧化碳5%；37℃培养。

非洲绿猴SV40转化的肾细胞（COS-1）

使用方法:

1.取出25cm2培养瓶,75%酒精消毒,拆下封口膜,放入37℃,5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜,以稳定细胞状态。

2.待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。

3.细胞传代

1)吸出25cm2培养瓶中的培养基,用PBS清洗细胞一次;

2)添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中,37℃温浴3min左右;倒置显微镜下观察,待细胞回缩变圆后吸弃消化液,再加入完全培养液终止消化;

3)用吸管轻轻吹打混匀,按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代,然后补充新鲜的完全培养基至5mL,放入37℃,5%CO2细胞培养箱中培养;

4)待细胞完全贴壁后,培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

应用^[4][5]

用于hBD1稳定表达细胞株的建立及其表达产物对多重耐药菌的活性检测研究

构建人β防御素-1（hBD-1）稳定表达细胞株,并检测表达产物人p防御素-1对多种多重耐药菌的抗菌活性。

方法：将重组质粒pCMV-hBDl通过阳离子脂质体转染于非洲绿猴SV40转化的肾细胞（COS-7细胞）,经过G418压力筛选后获得单克隆细胞株；提取细胞总RNA,RT-PCR检测目的基因在转录水平的表达；收集细胞培养上清液,Western blotting检测hBDl基因蛋白的表达；将含有表达产物hBDl的细胞培养上清液分别同各耐药菌液混合,37℃孵育不同时间后涂布于LB平板,以各实验组和对照组的菌落数的比值作为该耐药菌的存活率。

结果：1.经过G418压力筛选所得到的稳定表达细胞株,在转录水平和蛋白水平均检测到目的基因hBDl的表达,成功获得人p防御素-1（hBD-1）稳定表达细胞株；

2. 当耐药菌菌液浓度为2×104个/m1时,在表达产物hBD1的作用下,多重耐药鲍氏不动杆菌、多重耐药大肠埃希菌和多重耐药肺炎克雷伯杆菌的存活率可以分别降至9%、22%和50%；

3. 当耐药菌菌液浓度为1×104个/ml时,在表达产物hBD1的作用下,多重耐药鲍氏不动杆菌、多重耐药大肠埃希菌和多重耐药肺炎克雷伯杆菌的存活率可以分别降至12%、19%和46%；

4. 多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌在表达产物hBD1的作用下,其存活率同对照组没有明显差异。

结论：成功建立hBDl稳定表达细胞株,目的基因hBD1的表达产物对多重耐药鲍氏不动杆菌、多重耐药大肠埃希菌和多重耐药肺炎克雷伯杆菌均具有抗菌活性。目的研究0-胆甾醇基壳聚糖（O-CHCS）作为基因载体进行人β防御素-2（hBD2）基因转染小鼠纤维母细胞（L929）的可行性及检测目的基因表达产物的生物活性。方法构建重组质粒pCMV-hBD2,通过O-CHCS介导转染于L929细胞,提取转染细胞总RNA,用RT-PCR检测hBD2基因转录水平；收集转染细胞培养上清液,用Western blotting检测hBD2基因蛋白的表达；用Kirby-Bauer纸片法检测hBD2抗菌活性,同时以Lipofect脂质体转染试剂作为阳性对照。

结果经过O-CHCS介导转染的L929细胞,目的基因hBD2在转录水平和蛋白水平均有表达,转染细胞上清液对金黄色葡萄球菌有抑菌圈形成,结果同Lipofect的转染效果基本一致。结论成功构建了真核表达载体pCMV-hBD2,证实了O-CHCS可以作为基因载体用于目的基因（hBD2）的转染,且目的基因表达产物具有生物活性,为基因工程合成hBD2提供一种经济便捷的途径。

参考文献

[1]Humanβ-defensin 1:A restless warrior against allergies,infections and cancer[J].Ernesto Prado-Montes de Oca.International Journal of Biochemistry and Cell Biology.2010(6)

[2]Association of a genetic polymorphism（-44 C/G SNP）in the human DEFB1 gene with expression and inducibility of multiple beta-defensins in gingival keratinocytes.[J].Kalus Andrea A,Fredericks L Page,Hacker Beth M,Dommisch Henrik,Presland Richard B,Kimball Janet R,Dale Beverly A.BMC oral health.2009(1)

[3]Modulation of humanβ-defensin-2 expression by 17β-estradiol and progesterone in vaginal epithelial cells[J].June Hyun Han,Min Su Kim,Moo Yeol Lee,Tae Hyoung Kim,Mi-Kyung Lee,Hye Ryoun Kim,Soon Chul Myung.Cytokine.2009(2)

[4]Antibacterial activity of oleoyl-chitosan nanoparticles:A novel antibacterial dispersion system[J].Ke Xing,Xi Guang Chen,Yan Yan Li,Cheng Sheng Liu,Chen Guang Liu,Dong Su Cha,Hyun Jin Park.Carbohydrate Polymers.2008(1)

[5]崔南.hBD1稳定表达细胞株的建立及其表达产物对多重耐药菌的活性检测[D].兰州大学,2012.