JAR(胎盘绒毛癌细胞)的应用

背景^[1-3]

JAR(胎盘绒毛癌细胞)源自一位男性胎儿胎盘滋养层肿瘤的上皮细胞样贴壁细胞，生长培养基：RPMI-1640＋10%FBS)＋1%P/S。

JAR(胎盘绒毛癌细胞)

细胞培养操作：

一、培养基及培养冻存条件准备：

准备RPMI-1640培养基，90%；优质胎牛血清，10%。

培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化2-3分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1200RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-3步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

应用^[4][5]

用于新基因F10参与滋养细胞肿瘤病理机制的研究

探讨葡萄胎病理相关新基因F10对绒癌细胞系成瘤性的影响,我们通过基因转染及基因沉默技术,获得F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞系JEG-3、BEWO,并用F10基因稳定过表达和沉默绒癌细胞株制备裸鼠绒癌动物模型,观察裸鼠皮下肿瘤生长情况,并通过检测成瘤组织中F10的表达水平,以验证F10蛋白在过表达组、沉默组及正常对照组中的表达差异,从而确认动物模型构建的成功,初步探讨F10基因与绒癌细胞致瘤性的关系。

方法：针对F10基因分别设计并构建F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞JEG-3、JAR单克隆细胞和F10沉默处理的BEWO细胞,而未处理的JEG-3、JAR、BEWO细胞作为正常对照组。经体外培养后,收集对数生长期细胞,制备细胞悬液。将80只裸鼠随机均分为JEG-3 F10过表达组、JEG-3对照组和JEG-3 F10沉默组；JAR F10过表达组、JAR对照组和JAR F10沉默组；BEWO对照组和BEWO F10沉默组（n=10）,以75%乙醇消毒裸鼠局部皮肤,1ml无菌注射器吸取预先制备的细胞悬液（0.2ml/只,含细胞5×107个）接种于动物颈背部皮下。观察皮下成瘤情况,记录裸鼠肿瘤发生时间；计算各组裸鼠的成瘤率；绘制在体肿瘤生长曲线；细胞接种5周后处死小鼠,取瘤组织称重,比较各组瘤体重量。收集各组瘤体组织,通过免疫组化法及Western blot法检测F10分别在JEG-3、JAR,BEWO各组肿瘤组织中的表达情况。

所有数据资料采用均数±标准差（x±s）表示,在体肿瘤生长曲线的比较采用重复测量方差分析。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）,进一步两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用两独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结果1、裸鼠皮下肿瘤的成瘤时间、成瘤率及瘤体重量

2、JEG-3三组成瘤率均为100%（10/10）。单因素方差分析显示：三组的成瘤时间（分别为7±2.49d、6.3±0.67d、6.2±0.78d）无统计学差异（F=0.781,P=0.468）。三组肿瘤重量（分别为571.1±221.10mg、354.5±116.23mg、136.2±66.25mg）,存在统计学差异（F=21.199,P=0.000）。JEG-3 F10过表达组体重均较JEG-3 F10沉默组、JEG-3对照组重,JEG-3对照组较JEG-3 F10沉默组重。

3、JAR三组成瘤率均为100%（10/10）。单因素方差分析显示：三组的成瘤时间（分别为4.0±1.07d、4.4±1.07d、4.6±1.35d）无统计学差异（F=0.097,P=0.908）。三组肿瘤重量（分别为607.49±216.19mg、423.87±74.75mg、270.73±81.53mg）,存在统计学差异（F=14.462,P=0.000）。JAR F10过表达组体重均较JAR F10沉默组、JAR对照组重,JAR对照组较JAR F10沉默组重。

4、BEWO两组成瘤率均为100%（10/10）。两独立样本t检验结果显示:两组的成瘤时间（分别为4.5±1.43d、4.1±1.29d）无统计学差异（t=0.657,P=0.520）。两组肿瘤重量（分别为118.50±22.53mg、85.90±20.41mg）,存在统计学差异（t=-3.339,P=0.004）。BEWO对照组较BEWO F10沉默组重。

参考文献

[1]STAT 3 and ERK 1/2 Cross‐talk in Leukaemia Inhibitory Factor Mediated Trophoblastic JEG‐3 Cell Invasion and Expression of Mucin 1 and Fos[J].Pankaj Suman,Satish Kumar Gupta.Am J Reprod Immunol.2014(1)

[2]Role of JNK Activation and Mitochondrial Bax Translocation in Allicin-Induced Apoptosis in Human Ovarian Cancer SKOV3 Cells[J].Ling Xu,Jin Yu,Dongxia Zhai,Danying Zhang,Wei Shen,Lingling Bai,Zailong Cai,Chaoqin Yu,Leo M.Lee.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.2014

[3]The role of interleukin-1βin human trophoblast motility[J].Placenta.2012(9)

[4]MicroRNA expression profiles of trophoblastic cells[J].D.M.Morales-Prieto,W.Chaiwangyen,S.Ospina-Prieto,U.Schneider,J.Herrmann,B.Gruhn,U.R.Markert.Placenta.2012(9)

[5]苏晓华.新基因F10参与滋养细胞肿瘤病理机制的研究[D].南方医科大学,2015.