HEB人脑星型胶质正常细胞的应用

背景^[1-3]

HEB人脑星型胶质正常细胞分离自人脑组织的星型胶质贴壁细胞，不含真菌、细菌、HIV、支原体、衣原体等污染。

细胞分离方法：

1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。

2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。

3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。

4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细胞密度。

5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。

HEB人脑星型胶质正常细胞

复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约6ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心5分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

应用^[4][5]

用于人脑颞叶局灶性皮层发育不良临床特征及发病机制研究

人脑颞叶癫痫相关性局灶性皮层发育不良超微结构观察分析目的：通过对不同病理亚型FCD手术标本进行电镜观察，了解FCD超微结构改变。

方法：对单纯型FCD组，结合型FCD组和对照组的手术标本分别进行透射电镜观察，分析其超微结构的改变。

结果：1.单纯型FCD：神经元形态异常，细胞器明显减少或消失，部分神经元中可见脂褐质颗粒。线粒体嵴模糊，部分缩短或缺失。基质颗粒减少或消失。线粒体增生肥大，线粒体膜破裂。内质网扩张。胶质细胞肿胀，有髓神经纤维排列混乱，髓鞘细胞膜结构稀疏。髓鞘内外层轻度分离。

2. 结合型FCD：神经元细胞质水肿，细胞器数量明显减少或消失，线粒体肥大和增生。粗面内质网轻度扩张。有髓神经髓鞘明显增生增厚分层，有髓神经髓鞘增生形状极度不规则，无序排列，髓索变小，水肿，髓内容物减少，髓鞘细胞膜结构稀疏。髓鞘外层与内层分离，线粒体与微丝微管数量减少。

3. 对照组：未发现明显脑组织异常改变，神经元形态规则，排列紧密，核仁清楚，染色质排列均匀一致。

结论：FCD其本身也可能具有致痫性，具有癫痫发作的结构基础，结合型FCD中有髓神经纤维受损更加明显。

人脑颞叶局灶性皮层发育不良哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达分析目的：通过检测不同病理亚型FCD患者术后病理组织的mTOR信号通路的表达情况，观察mTOR信号通路在FCD发病机制中的意义。

方法：应用免疫组化、免疫荧光、Western-blot方法对不同病理亚型FCD患者的AKT、mTOR、p70S6K及p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K进行检测，观察mTOR信号通路在不同病理亚型FCD的表达。

结果：AKT、mTOR、p70S6K在正常脑组织及FCD I型组、FCD IIIa型组内可见少量锥体神经元胞体及星型胶质细胞呈弱阳性表达。在FCDIIIa型中观察到p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K在少量锥体神经元胞体弱阳性表达，与FCD I型及正常脑组织表达程度相似。在星型胶质细胞p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K呈明显中度阳性表达，表达部位主要在胞浆，表达强度明显强于FCD I型及正常脑组织。

结论：在FCD IIIa型中的星型胶质细胞中p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K的表达增加，提示PI3K-AKT-mTOR通路异常激活可能是参与FCD IIIa型的发病机制。在FCD IIIa型中的星型胶质细胞中PI3K-AKT-mTOR通路异常激活，而FCD I型PI3K-AKT-mTOR信号通路没有异常激活，FCDIIIa型和FCD I型在发病机制上可能存在差异。

参考文献

[1]The mTOR pathway is activated in glial cells in mesial temporal sclerosis[J].Alexander A.Sosunov,XiaopingWu,Robert A.McGovern,David G.Coughlin,Charles B.Mikell,Robert R.Goodman,Guy M.McKhann.Epilepsia.2012

[2]“MRI-negative PET-positive”temporal lobe epilepsy:Invasive EEG findings,histopathology,and postoperative outcomes[J].Epilepsy and Behavior.2011(3)

[3]An Introduction to Diffusion Tensor Image Analysis[J].Lauren J.O’Donnell,Carl-Fredrik Westin.Neurosurgery Clinics of North America.2011(2)

[4]Enhanced GABAergic network and receptor function in pediatric cortical dysplasia Type IIB compared with Tuberous Sclerosis Complex[J].Carlos Cepeda,Véronique M.André,Jason S.Hauptman,Irene Yamazaki,My N.Huynh,Julia W.Chang,Jane Y.Chen,Robin S.Fisher,Harry V.Vinters,Michael S.Levine,Gary W.Mathern.Neurobiology of Disease.2011(1)

[5]武江.人脑颞叶局灶性皮层发育不良临床特征及发病机制研究[D].河北医科大学,2014.