NB-4人急性早幼粒白血病细胞的应用

背景^[1-3]

NB-4人急性早幼粒白血病细胞由Collins SJ从一位患有急性早幼粒细胞性白血病的36岁白人女性的外周血中分离建立；可自发分化，或在丁酸盐、次黄嘌呤、佛波醇肉豆蔻酸(PMA,TPA)、DMSO(1%to 1.5%)、放线菌素D和视黄酸的刺激下发生分化；PMA刺激后可分泌TNF-α。该细胞具有吞噬活性和趋化反应，癌基因myc阳性，表达补体受体和FcR。

NB-4人急性早幼粒白血病细胞

急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)是急性髓系白血病中具有独特形态学和细胞遗传学特征的一种类型，临床以严重的出凝血障碍为特征。

培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）NB-4人急性早幼粒白血病细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

用于丹参酮ⅡA对ATO抗人急性早幼粒细胞白血病的化疗增敏作用及其机制的实验研究

从细胞凋亡和自噬角度,探讨TanⅡA、TanⅡA联合ATO对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4生长的影响作用及其可能的分子机制和调控机制;建立人急性早幼粒细胞性白血病裸鼠模型,探讨TanⅡA、TanⅡA联合ATO在活体内对NB4移植瘤生长的影响作用及其分子机制,为临床采用TanⅡA治疗或辅助治疗白血病策略提供实验和理论依据。

方法体外实验部分:（1）体外培养人急性早粒幼细胞白血病NB4细胞株,将对数生长期NB4细胞分为6组,分别加入4、8、16mg/ml TanⅡA、0.5mg/ml ATO及8mg/ml TanⅡA+0.5mg/mlATO,对照组加入等体积的生理盐水;

（2）CCK-8法检测一定时间点上各组细胞增殖活力;凋亡抑制剂z-VAD-fmk或自噬抑制剂3-MA预孵育NB4细胞1h后,再加入8、16mg/ml TanⅡA处理,CCK-8法分别检测它们对TanⅡA抗NB4细胞增殖作用的影响;

（3）流式细胞术检测各组NB4细胞的凋亡率和自噬率;

（4）Western blotting检测凋亡特异蛋白Caspase-3及自噬特异蛋白Beclin-1、LC3-II、P62的表达水平;

（5）Western blotting检测PI3K-I/Akt/mTOR信号通路蛋白的磷酸化水平;

（6）RT-PCR法检测beclin-1 mRNA、bcl-2 mRNA的转录水平。

体内实验部分:（1）将人急性早粒幼细胞白血病NB4细胞接种于BALB/C-nu/nu裸鼠皮下,建立荷人急性早幼粒白血病NB4细胞移植瘤裸鼠模型;

（2）随机将30只接种NB4细胞的裸鼠分为4组:TanⅡA组、ATO组、TanⅡA联合ATO组、生理盐水对照组,腹腔注射法给予实验设定药物;

（3）用游标卡尺测量移植瘤块的平均体积,绘制移植瘤生长曲线;

（4）给药后的第15天,处死裸鼠并称重剥离瘤块,比较各组抑瘤率（%）;

（5）瑞氏、HE染色后,光学显微镜下观察各组裸鼠的骨髓、心、肝、肾、淋巴结等重要组织器官有无病理学损害;

（6）Western blotting检测各组移植瘤组织中凋亡特异蛋白Caspase-3、自噬特异蛋白LC3-II的表达水平。

结果体外实验部分:（1）TanⅡA对NB4增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性,联合用药组对NB4细胞增殖的抑制率大于TanⅡA、ATO单药组,差异具有统计学意义（P<0.01）;

（2）凋亡抑制剂z-VAD-fmk预孵育干预后,TanⅡA组NB4细胞的增殖抑制率较干预前明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;

（3）自噬抑制剂3-MA预孵育干预后,TanⅡA组NB4细胞的增殖抑制率较干预前增加10%以上,差异具有统计学意义（P<0.05）;

（4）TanⅡA可诱导NB4细胞发生凋亡和自噬,均呈时间和浓度依赖性;联合用药组诱导NB4细胞的凋亡率和自噬率均大于TanⅡA、ATO单药组（P<0.01）;

（5）Western blotting检测结果显示,TanⅡA联合ATO组NB4细胞中凋亡特异蛋白Caspase-3和自噬特异性蛋白Beclin-1和LC3-II的相对表达量高于对照组,亦高于TanⅡA、ATO单药组,差异具有统计学意义（P<0.05）;联合用药组NB4细胞中自噬特异蛋白P62的表达量明显低于对照组,亦明显低于TanⅡA、ATO单药组,差异均具有统计学意义（P<0.05）;

（6）Western blotting检测结果显示,TanⅡA联合ATO组NB4细胞中p-PI3K-I、p-Akt和p-mTOR蛋白条带相对表达量较对照组增高,亦高于TanⅡA、ATO单药组,差异均具有统计学意义（P<0.01）;

参考文献

[1]In vivo hair growth-stimulating effect of medicinal plant extract on BALB/c nude mice[J].Shahnaz Begum,Li-Juan Gu,Mi-Ra Lee,Zheng Li,Jing-Jie Li,Md.Jamil Hossain,Yun-Bo Wang,Chang Keun Sung.Pharmaceutical Biology.2015(8)

[2]The Contribution of Proteinase-Activated Receptors to Intracellular Signaling,Transcellular Transport and Autophagy in Alzheimers Disease[J].Radoslav Matej,Zdenek Rohan,Karel Holada,Tomas Olejar.Current Alzheimer Research.2015(1)

[3]miR?143 inhibits cell proliferation by targeting autophagy?related 2Bin non?small cell lung cancer H1299 cells[J].Jiali Wei,Zhongliang Ma,Yanli Li,Botao Zhao,Detao Wang,Yan Jin,Youxin Jin.Molecular Medicine Reports.2015(1)

[4]Autophagy in lung disease pathogenesis and therapeutics[J].Stefan W.Ryter,Augustine M.K.Choi.Redox Biology.2015

[5]王叨.丹参酮ⅡA对ATO抗人急性早幼粒细胞白血病的化疗增敏作用及其机制的实验研究[D].郑州大学,2015.