3T3-L1/小鼠胚胎成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞是通过克隆分离得到的3T3(swiss小白鼠)的连续亚株。当细胞从快速分裂到长满且接触抑制时，该细胞经过前脂肪向脂肪样逆转。培液中，高血清含量可以促进脂肪积累。

3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基(添加NaHCO3 1.5g/L)，90%；牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

用于奥氮平介导的3T3-L1细胞SREBPs通路的脂代谢调控与药物联合作用研究

通过Berberine通过调节SREBPs相关途径（包括PPARγ和C/EBPα）,抑制3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞、人类白前脂肪细胞以及高脂肪饮食诱导的肥胖鼠模型中的脂肪细胞分化过程中脂肪生成。因此Berberine与Olanzapine联合用药,能否干预Olanzapine介导的3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞脂代谢变化,从而应用于临床上Olanzapine引起的脂代谢紊乱,值得研究。

在3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪细胞）水平上,建立Olanzapine诱发脂代谢的成熟脂肪细胞模型,研究Olanzapine通过SREBPs途径诱发的脂代谢副作用,分析他汀类药物和Berberine对其的干预作用及其分子机制。

方法：采用MTT比色法考察DMSO、Olanzapine、Simvastatin、Atorvastatin、Berberine等对3T3-L1细胞增殖的影响,从而找出上述药物具有较低细胞毒性的浓度范围；利用倒置显微镜观察细胞形态、油红O染色脂滴,试剂盒检测TG、TC含量,RT-qPCR基因转录分析及Western blotting分析蛋白表达四个方面来考察Olanzapine是否成功诱导形成成熟脂肪细胞模型,并且选出的Olanzapine浓度；在此基础上选择以上四个方面来研究他汀类药物和Berberine是否干预Olanzapine介导的脂代谢变化以及相关分子机制。

结果：1.Olanzapine介导的脂代谢变化细胞模型的建立Olanzapine能促进脂肪细胞脂滴的形成,在低于10μmol/L浓度,呈剂量依赖性,超过10μmol/L后诱导效果不明显。并且在10μmol/L浓度时对TG,TC含量、基因转录水平、蛋白表达水平都有一定的下调作用。

2. Simvastatin对Olanzapine引起的脂代谢变化的干预作用在2.5μmol/L和5μmol/L Simvastatin作用下,可看到细胞形态观察的改变以及油红O染色脂滴数量的下降,TG,TC含量测定、基因转录分析及蛋白表达水平方面都进一步验证了Simvastatin可以干预Olanzapine引起的脂代谢变化。

3.Atorvastatin对Olanzapine诱发的脂代谢变化的影响在2.5μmol/L和5μmol/L Atorvastatin作用下,基本上看不到细胞形态观察的改变以及油红O染色脂滴数量的下降,在TG、TC含量测定、基因转录分析及蛋白表达水平等方面也没有较大的变化。

参考文献

[1]The Role of Hypothalamic H1 Receptor Antagonism in Antipsychotic-Induced Weight Gain[J].Meng He,Chao Deng,Xu-Feng Huang.CNS Drugs.2013(6)

[2]Berberine inhibits SREBP‐1‐related clozapine and risperidone induced adipogenesis in 3T3‐L1 cells[J].YueshanHu,EricKutscher,Gareth E.Davies.Phytother.Res..2010(12)

[3]Statin use and cancer risk:a comprehensive review[J].Denise M Boudreau,Onchee Yu,Jeanene Johnson.Expert Opinion on Drug Safety.2010(4)

[4]Haloperidol activates quiescent oligodendroglia precursor cells in the adult mouse brain[J].Hanzhi Wang,Haiyun Xu,Jianqin Niu,Feng Mei,Xinmin Li,Jiming Kong,Wenqin Cai,Lan Xiao.Schizophrenia Research.2010(1)

[5]李彦杰.奥氮平介导的3T3-L1细胞SREBPs通路的脂代谢调控与药物联合作用[D].西南大学,2014.