MS1小鼠胰岛内皮细胞的应用

背景^[1-3]

MS1小鼠胰岛内皮细胞是1994年建株的胰岛内皮细胞株。原代培养的胰岛内皮细胞用抗G418的温度敏感型SV40大T抗原(tsA-58-3)转染。抗性克隆用克隆环分离，并筛选吸收dil-Ac-LDL的。这株细胞保留了内皮细胞的许多特性，如吸收乙酰化LDL和表达八因子相关抗原及BEGF受体。

MS1小鼠胰岛内皮细胞

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

应用^[4][5]

用于高糖致胰岛微血管内皮细胞凋亡的机制及年龄相关胰岛β细胞再生的研究

围绕高糖致胰岛微血内皮细胞凋亡展开研究

1. 以小鼠胰岛微血管内皮细胞（MS-1细胞）为研究对角,探讨高糖对胰岛微血管内皮细胞凋亡的影响。2.使用JNK抑制剂、iNOS抑制剂干预胰岛微血内皮细胞,探讨高糖引起胰岛微血管内皮细胞调亡分子机制。

研究方法1.细胞培养、分组MS-1细胞（小鼠胰岛微血管内皮细胞）用正常浓度葡萄糖（5.5mmol/l葡萄糖）、甘露醇（5.5mmol/l葡萄糖+24.5mmol/l甘露醇）或高糖（30mmol/l葡萄糖）刺激7天。按需要加入SP600125（JNK抑制剂,30μmol/l）或1400W（iNOS抑制剂,20μmol/l）预刺激1小时,再进行高糖刺激。

2. Hoechst33258染色将细胞培养在24孔板内,刺激结束后用Hoechst33258染色,共聚焦显微镜下观察凋亡细胞核的改变,并测凋亡率。

3. 流式细胞仪检测凋亡将细胞培养在6孔板内,刺激结束后使用annexin-V-PI染色,使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

4. Caspase-3活性检测使用Caspase-3活性检测试剂盒,严格按照试剂盒步骤进行。

5. ROS及O2-的检测ROS将细胞培养在24孔板内,刺激结束后用DCFH-DA孵育,共聚焦显微镜拍照,通过荧光相对强度评价细胞内ROS的水平。02-将细胞培养在24孔板内,刺激结束后用dihydroethidium（O2一的荧光探针）孵育,共聚焦显微镜拍照,通过荧光相对强度评价细胞内O2-的水平。

6. 免疫荧光染色细胞种植在圆形玻片上,刺激组束后,用4%多聚甲醛固定,0.03%TritonX-100透膜,10%胎牛血清封闭,一抗过夜后加入二抗。共聚焦显微镜下立即观察、拍照。

7. Western blot细胞刺激结束后提取蛋白,上样后跑胶,牛奶封闭,一抗孵育过夜,二抗后加入显影剂显影、定影。

8. NO的测定使用总NO检测试剂盒,严格按照试剂盒步骤进行。

结果1.抑制.JNK或iNOS可以减少高糖引起的MS-1细胞凋亡流式细胞仪及Hoechst33258染色检测显示,高糖组的细胞凋亡率与正常糖组相比有显著性差异；而渗透压对照组与正常糖组相比无显著性差异。使用JNK抑制剂SP600125（30μmol/l）和iNOS抑制剂1400W（20μmol/l）干预高糖下的MS-1细胞,SP600125及1400W可以显著降低高糖引起的MS-1细胞凋亡。

2. 抑制JNK或iNOS可以减少高糖刺激下MS-1细胞iNOS蛋白的表达,减少NO、氧化亚硝酸盐的生成Western blot及细胞免疫荧光染色显示高糖组与正常糖组相比较,iNOS蛋白的表达及氧化亚硝酸盐生成显著升高。SP600125干预或1400W干预均可使高糖刺激下iNOS蛋白的表达显著下降,同时氧化亚硝酸盐生成显著减少。检测各组细胞培养基中的总NO生成量。结果显示NO的生成呈时间依赖性,在48h时,高糖组与正常糖组相比有显著差异。同时,SP600125干预组及1400W干预颅组的NO生成量与iNOS表达量相一致,与高糖组相比均有显著性差异。

3. 高糖可以增加MS-1细胞中ROS及02-的产生与正常糖组相比较,高糖可以显著增加MS-1细胞中ROS及02-的产生但渗透压对照组无明显差异。

4.抑制JNK通路可以通过下调iNOS的表达减少高糖下MS-1细胞的凋亡Western blot及细胞免疫荧光染色显示在高糖刺激下,MS-1细胞中的P-JNK蛋白水平显著增高,但T-JNK蛋白水平无明显变化。SP600125及1400W可以显著减少JNK的磷酸化以及MS-1细胞的凋亡5.高糖通过激活JNK通路调节bax、bal-2的蛋白表达Western blot显示高糖下MS-1细胞中bax蛋白表达显著增加,但bcl-2蛋白表达水平没有明显的改变。bax蛋白表达的增加可以被SP600125所抑制。此外高糖刺激下bax与bcl-2的比值显著升高,但可以被SP600125所抑制。

参考文献

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[2]Reg IV is differently expressed in enteroendocrine cells of human small intestine and colon[J].Kukka Heiskala,Leif C.Andersson.Regulatory Peptides.2013

[3]Enhanced NF-[kappa] Activity Impairs Vascular Function Through PARP-1-,SP-1-,and COX-2-Dependent Mechanisms in Type 2 Diabetes[J].Kassan,Modar,Choi,Soo-Kyoung,Galán,Maria,Bishop,Alexander,Umezawa,Kazuo,Trebak,Mohamed,Belmadani,Souad,Matrougui,Khalid.Diabetes.2013(6)

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[5]龚蕾.高糖致胰岛微血管内皮细胞凋亡的机制及年龄相关胰岛β细胞再生的研究[D].山东大学,2013.