SV-HUC-1(人输尿管上皮永生化细胞)的应用

背景^[1-3]

SV-HUC-1(人输尿管上皮永生化细胞)是正常输尿管组织用SV40病毒转染建株的。反复用非洲绿猴肾细胞平板测试检测传染性SV40的生成，结果都呈阴性；SV-HUC-1细胞在胁迫(如曝露于化学试剂)下可能激活病毒。

SV-HUC-1(人输尿管上皮永生化细胞)

细胞处理方法:

1、贴壁生长的细胞用T25细胞培养瓶发货,收到细胞后,拆开包装T25瓶的自封袋,不拆封口膜,表面喷75%酒精消毒。

2、消毒后用显微镜观察细胞状态,并拍下细胞照片。

3、将细胞放入37度培养箱平衡两小时以上,平衡是为了让细胞尽快适应培养箱环境。

4、平衡后将T25瓶中培养基吸出用离心管装好备用。

5、如细胞密度高于80%,可以直接消化传代,相反则加入5-6mL培养基放回培养箱继续培养即可。

细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

应用^[4][5]

用于SPOCK1基因对膀胱癌细胞侵袭和增殖的影响研究

SPOCK1（Sparc/osteonectin cwcv and kazal-like domains proteoglycan 1）基因编码的细胞外基质糖蛋白,被证实与多种肿瘤细胞的增殖、黏附及转移密切相关。在肿瘤细胞中SPOCK1基因过表达能够促进肿瘤细胞侵袭转移;反之,沉默SPOCK1的表达可使肿瘤细胞丧失其转移能力。在膀胱癌组织中,已发现SPOCK1基因存在高表达,并且SPOCK1高表达与尿路上皮癌预后差有关。

通过在膀胱癌细胞中降低SPOCK1基因,观察其侵袭和增殖的改变,了解SPOCK1基因对膀胱癌发生发展的影响,从而为膀胱癌机制研究提供实验理论依据。

目的:1、验证在膀胱癌细胞中SPOCK1基因的表达情况。2、通过体外细胞实验进一步研究SPOCK1基因对膀胱癌细胞侵袭和增殖的影响。

方法:1、q RT-PCR和Western Blot方法检测人输尿管上皮永生化细胞（SV-HUC-1）,膀胱癌细胞株5637以及膀胱癌细胞株T24中目的基因SPOCK1的表达情况。

2、构建SPOCK1小干扰RNA片段（si RNA）,采用脂质体介导转染至膀胱癌细胞株5637中。我们将实验分组为空白对照组（Control cells group）、无义序列组（Scrambled si RNA group）和实验组（SPOCK1 si RNA group）。通过q RT-PCR检测各组SPOCK1m RNA相对表达量情况,Western Blot方法检测转染后SPOCK1蛋白的变化,筛选干扰序列。

3、使用RNAi技术下调膀胱癌细胞株5637中SPOCK1基因的表达,分别使用划痕实验,Transwell法和CCK-8法检测降低SPOCK1基因的表达后膀胱癌细胞侵袭和增殖能力的改变情况。

结果:1、q RT-PCR和Western Blot方法检测结果表明,SPOCK1基因相关m RNA和蛋白在膀胱癌细胞系中存在过表达现象,并且在膀胱癌细胞株5637中表达较膀胱癌细胞株T24更高。

2、同其它的干扰序列相比,SPOCK1-si RNA-2序列干扰效果（P<0.05）。

3、使用RNAi技术下调膀胱癌细胞株5637中SPOCK1基因表达,通过划痕实验,Transwell法和CCK-8法检测发现膀胱癌细胞侵袭和增殖能力明显受到抑制。

结论:1、SPOCK1基因在膀胱癌细胞中存在高表达。2、SPOCK1基因的高表达促进了膀胱癌细胞的侵袭和增殖能力,其可能成为膀胱癌基因治疗的候选靶点。

参考文献

[1]EPCR promotes breast cancer progression by altering SPOCK1/testican 1-mediated 3D growth[J].Naiara Perurena,Carolina Zandueta,Susana Martínez-Canarias,Haritz Moreno,Silvestre Vicent,Ana S.Almeida,Elisabet Guruceaga,Roger R.Gomis,Marta Santisteban,Mikala Egeblad,JoséHermida,Fernando Lecanda.Journal of Hematology&Oncology.2017(1)

[2]Integrative radiogenomic analysis for genomic signatures in glioblastomas presenting leptomeningeal dissemination[J].Hye Jin You,Ho-Young Park,Jinkuk Kim,In-Hee Lee,Ho Jun Seol,Jung-Il Lee,Sung Tae Kim,Doo-Sik Kong,Do-Hyun Nam.Medicine.2016(27)

[3]SPOCK1 is upregulated in recurrent glioblastoma and contributes to metastasis and Temozolomide resistance[J].Fengbo Yu,Guihong Li,Junxia Gao,Yuxue Sun,Pengfei Liu,Haijun Gao,Peiwen Li,Ting Lei,Yong Chen,Ye Cheng,Xiao Zhai,Arash.J.Sayari,Haiyan Huang,Qingchun Mu.Cell Proliferation.2016(2)

[4]Integrated microRNA–mRNA analysis of coronary artery disease[J].Fei Chen,Xin Zhao,Juan Peng,LinPing Bo,Bing Fan,Duan Ma.Molecular Biology Reports.2014(8)

[5]吴常文.SPOCK1基因对膀胱癌细胞侵袭和增殖的影响[D].南昌大学,2017.