真菌总蛋白质微量提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

真菌总蛋白质微量提取试剂盒适用于从各种大型真菌（蕈菌）类样本中提取总蛋白。试剂盒组分针对厚细胞壁样本进行优化，提取过程简单方便，可在1小时内完成。该试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。提取的蛋白可用于WesternBlotting、蛋白质电泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。

真菌总蛋白质微量提取试剂盒

真菌总蛋白质微量提取试剂盒专门用于快速提取微量真菌蛋白用于SDS-PAGE凝胶电泳和Western印迹分析。本产品结合玻璃珠破壁和化学法破壁两种方法,适合于各种形态的各种酵母材料。本产品的其主要特点是:

1.破壁效率高,能达到80-90%。

2.可以处理各种酵母样品。

3.操作简单,得到的裂解液可以直接用于SDS-PAGE和Western印迹分析。

使用方法：

1．提取液制备：每500μl冷的真菌蛋白提取液中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物，4μl蛋白稳定剂，混匀后置冰上备用。

2．取100mg组织样本剪碎①，置于研钵中用液氮研磨。(没有液氮研磨条件也可直接加入提取液后置冰上研磨即可)

3．研磨后加入500μl真菌蛋白提取液。

4．混匀后，在4℃条件下振荡20-30分钟。

5.在4℃，14000rpm条件下离心10分钟。

6．快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到真菌总蛋白。

7．将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

应用^[4][5]

用于温度对深黄被孢霉M6-22蛋白质表达谱的影响研究

蛋白的提取是蛋白质组学研究的首要步骤,其质量的好坏直接影响蛋白质表达分析研究的开展及其结果的准确性。为了从深黄被孢霉M6-22中提取细胞总蛋白质并进一步进行蛋白组学等一些相关研究,采用五种已报道的蛋白质提取方法分别提取深黄被孢霉M6-22的总蛋白质,以蛋白质浓度和SDS-PAGE结果相结合的方法比较提取方法。

结果显示,其中一种方法提取的蛋白质浓度相对较高而且蛋白质条带丰度最高,进一步对该方法进行了改良,所获得蛋白质的浓度可达约2.99 mg/ml。改进后的方法操作步骤简单,蛋白质条带丰度更高。采用改进后的方法提取其他五种真菌的总蛋白质,结果显示其对其他真菌也有很好的提取效果,说明可作为一种真菌总蛋白质的高效提取方法。用改进后的方法分别提取28℃和15℃培养的深黄被孢霉M6-22的总蛋白质,先经过透析除盐以降低盐份对向等电聚焦的影响,透析后的样品利用双向电泳技术分析两个温度下蛋白质表达谱的差异性,结果发现总共出现了111个差异变化的蛋白质,其中15℃上调的蛋白质有69个,15℃下调的蛋白质有42个,这些上调变化的蛋白质中有7个蛋白质只在15℃培养时才会表达,在15℃培养条件下没有出现表达抑制而消失的蛋白质。

选择61个分子量较小、差异比值为2倍以上蛋白质点进行质谱分析,成功的鉴定出41个蛋白质。将鉴定成功的蛋白质通过GO聚类分析进行功能的聚类,以分子功能为依据可以将差异性的蛋白质分为水解酶、转移酶、连接酶、ATP结合蛋白、GTP结合蛋白、转运蛋白和假定蛋白等;以生物学途径为依据可以将差异性的蛋白质分为细胞组件合成、糖代谢、核酸代谢、蛋白质代谢、有机酸代谢、蛋白质翻译和修饰、转录、运输和自我吞噬等相关的生命途径;以细胞组件为依据可以将差异性的蛋白质分为细胞膜、细胞器、细胞质、细胞核、细胞骨架等细胞组件。对聚类后的蛋白质进行分析发现深黄被孢霉对低温的响应涉及多个分子机理和生理代谢的网络综合响应,这对于人们从分子水平特别是蛋白质组水平认识深黄被孢霉以及丝状真菌的低温适应机制提供了一定的理论基础。

参考文献

[1]Screening of a Mortierella isabellina Mutant for Producing Arachidonic Acid[J].Gan Zhao,Kang Jie Chen,Shao Cong Wu,Qin Chuan Zhuang,Fang Qian.Advanced Materials Research.2013(641)

[2]Lignocellulosic biomass as a carbohydrate source for lipid production by Mortierella isabellina[J].Jijiao Zeng,Yubin Zheng,Xiaochen Yu,Liang Yu,Difeng Gao,Shulin Chen.Bioresource Technology.2013

[3]Oil production by Mortierella isabellina from whey treated with lactase[J].Muammer Demir,Irfan Turhan,Ahmet Kucukcetin,Zafer Alpkent.Bioresource Technology.2013

[4]Lipid composition of wine strains of Saccharomyces kudriavzevii and Saccharomyces cerevisiae grown at low temperature[J].Jordi Tronchoni,Nicolas Rozès,Amparo Querol,JoséManuel Guillamón.International Journal of Food Microbiology.2012(3)

[5]胡彬彬.温度对深黄被孢霉M6-22蛋白质表达谱的影响[D].昆明理工大学,2014.