H-4-II-E [H4-II-E](大鼠肝细胞瘤)的应用

背景^[1-3]

H-4-II-E[H4-II-E](大鼠肝细胞瘤)分离自大鼠肝细胞瘤，H-4-Ⅱ-E细胞可诱导产生芳香烃羟化酶，用于检测环境样品或食物提取物种皮克级的多氯联苯有机化合物。生长培养基MEM＋10%FBS＋1%P/S，培养气相条件：空气，95%；CO2，5%，温度：37℃。

H-4-II-E[H4-II-E](大鼠肝细胞瘤)

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。

应用^[4][5]

用于miR-200a在抑制成体肝干细胞恶性表型和功能中的调控作用及其机制研究

明确miR-200a在肝卵圆细胞系WB-F344及肝癌细胞系中的表达水平，进而研究miR-200a外源性功能抑制对WB-F344细胞表型及功能的影响，最后探讨miR-200a调控WB-F344细胞表型及功能的具体分子机制。

【方法】1.分别选择大鼠肝卵圆细胞系WB-F344，大鼠正常肝上皮细胞系BRL以及大鼠肝癌细胞系H-4-II-E，CBRH-7919，RH-35，利用qRT-PCR方法检测miR-200a在不同细胞中的表达水平，明确miR-200a在肝癌发生中的表达变化。

2. 构建慢病毒载体介导的miR-200a功能稳定抑制细胞系WB-anti-miR-200a及对照细胞系WB-miR-NC，分别从miRNA水平、mRNA水平及蛋白水平进行转染效率及功能鉴定。

3. 检测WB-anti-miR-200a细胞中HCSC相关表型及功能：具体包括生长增殖能力及自我更新能力（细胞计数实验、悬浮培养克隆球形成实验）；凋亡水平变化（FITC-Annexin V-PI染色、Caspase3/7活性检测）；HCSC标志物表达及肝系分化情况（qRT-PCR方法检测EpCAM、CD133、ABCG2、CK19、AFP、ALB等分子）；细胞耐药能力（流式细胞术检测细胞与化疗药物共培养后凋亡水平）；体内致瘤能力（裸鼠皮下成瘤检测）。

4. 鉴定WB-anti-miR-200a细胞的EMT特征：光镜观察细胞形态变化；Transwell迁移实验检测细胞体外运动能力；western-blot方法检测E-cadherin、Vimentin、N-cadherin等EMT特征蛋白表达。

5. miR-200a靶基因的预测、验证：TargetScan软件预测并筛选β-连环蛋白（β-catenin）作为miR-200a的可能靶基因；双荧光素酶报告基因检测系统外源性验证miR-200a对β-catenin的调节作用；western-blot方法内源性验证WB-anti-miR-200a细胞中β-catenin的表达变化。

6. 观察WB-anti-miR-200a细胞中Wnt/β-catenin通路的激活情况：细胞免疫荧光染色观察β-catenin的胞质及胞核表达情况；TopFlah/FopFlash报告基因实验检测β-catenin/T-细胞因子（T-cell factor，TCF）转录活性变化；western-blot方法检测Wnt/β-catenin通路下游分子c-Myc、cyclin D1的表达情况。

7. miR-200a通过调节β-catenin以及经典Wnt通路影响WB-F344细胞功能的鉴定：采用RNA干涉（RNAinterference，RNAi）技术瞬时下调WB-anti-miR-200a细胞中的β-catenin表达，观察细胞的自我更新能力（悬浮培养克隆球形成实验）及体外迁移能力（Transwell迁移实验）变化。

【结果】1.相对于WB-F344细胞及BRL细胞，miR-200a在3种肝癌细胞系H-4-II-E，CBRH-7919，RH-35中的表达水平均明显降低（P＜0.01）。

2. 慢病毒载体介导的WB-F344细胞中miR-200a功能抑制鉴定结果：WB-anti-miR-200a细胞中miR-200a表达明显下调（P＜0.01），其已知靶基因ZEB2mRNA表达水平无明显变化，但蛋白表达明显增强。

3.WB-anti-miR-200a细胞出现HCSC相关表型和功能：生长增殖加快、悬浮培养克隆球形成能力增强，但凋亡水平未发生变化；高表达EpCAM、CD133、ABCG2、AFP、CK19等HCSC细胞标志物、低表达肝系分化成熟标志物ALB（P＜0.05）；对化疗药物杀伤的抗凋亡能力增强（P＜0.05）；具备裸鼠皮下移植强致瘤性。

参考文献

[1]Regulation of microRNAs in cancer metastasis[J].Juliette M.C.Bouyssou,Salomon Manier,Daisy Huynh,Samar Issa,Aldo M.Roccaro,Irene M.Ghobrial.BBA-Reviews on Cancer.2014(2)

[2]MicroRNA-200a and-200b Mediated Hepatocellular Carcinoma Cell Migration Through the Epithelial to Mesenchymal Transition Markers[J].Chin-Sheng Hung,Hui-Hsiung Liu,Jun-Jen Liu,Chi-Tai Yeh,Tung-Cheng Chang,Chih-Hsiung Wu,Yuan-Soon Ho,Po-Li Wei,Yu-Jia Chang.Annals of Surgical Oncology.2013(3)

[3]Modeling Pathogenesis of Primary Liver Cancer in Lineage-Specific Mouse Cell Types[J].ágnes Holczbauer,Valentina M.Factor,Jesper B.Andersen,Jens U.Marquardt,David E.Kleiner,Chiara Raggi,Mitsuteru Kitade,Daekwan Seo,Hirofumi Akita,Marian E.Durkin,Snorri S.Thorgeirsson.Gastroenterology.2013(1)

[4]Downregulated microRNA-200a promotes EMT and tumor growth through thewnt/β-catenin pathway by targeting the E-cadherin repressors ZEB1/ZEB2 in gastricadenocarcinoma[J].Ningning Cong,Ping Du,Anling Zhang,Fajuan Shen,Juan Su,Peiyu Pu,Tao Wang,Jie Zjang,Chunsheng Kang,Qingyu Zhang.Oncology Reports.2013(4)

[5]刘杰.miR-200a在抑制成体肝干细胞恶性表型和功能中的调控作用及其机制研究[D].第四军医大学,2014.