SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞的应用

背景^[1-3]

SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞是由J·L·Bieder建系，它与SK-N-MC细胞所不同的是倍增时间较长，且多巴胺-β-羟基酶水平较高。SK-N-SH细胞在细胞介导的细胞毒性试验中用作靶细胞系。

SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞

人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH）培养步骤：

培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM培养基；优质胎牛血清，10%；+1%NEAA+1%Gluta-max+1%丙酮酸钠+1%P/S双抗

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1，细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

用于选择性环氧合酶-2抑制剂CAY10404抑制人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH生长的体外实验研究

神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是小儿最常见的恶性实体肿瘤之一,其恶性程度高,发病部位隐匿,较早发生多部位转移,手术切除率低,其对放射和化学疗法敏感度不高,而且极易产生耐受,因此病死率一直居高不下,严重威胁儿童生命健康。环氧合酶（cyclooxygenase,COX）又称前列腺素合成酶（prostaglandin synthetase,PGS）,是花生四烯酸（arachidonic acid,AA）合成前列腺素（prostaglandin,PG）的限速酶。近年来,在一些肿瘤组织中检测到COX-2的大量表达,选择性COX-2抑制剂可抑制肿瘤的生长。

研究选择性COX-2抑制剂CAY10404对人NB细胞SK-N-SH生长的抑制作用及其可能的机制。

[方法]人NB细胞株SK-N-SH于体外培养,每日于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。分别以30,60,90,120μmol/l浓度的CAY10404作用细胞,于不同的作用时间收集细胞,采用MTT比色法计算抑制率并绘制量-效曲线,胎盼蓝拒染法观察细胞群体倍增时间（TD）,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期变化,RT-PCR法检测bcl-2,bax,survivin基因的表达变化,采用免疫组化SP法观察药物处理前后COX-2,PCNA,Bcl-2,Bax,Survivin等蛋白的表达情况。

[结果]（1）不同浓度的CAY10404作用人NB细胞SK-N-SH后,其增殖受到抑制,其作用呈时间和剂量依赖性;

（2）免疫组化显示经CAY10404作用后,SK-N-SH细胞内COX-2和PCNA蛋白表达量较空白对照组明显下降;

（3）流式细胞仪表明经不同浓度CAY10404作用48h后,与空白对照组相比,细胞凋亡率增高,并呈剂量依赖关系,组间差异具有显著性（p<0.05）,低浓度组（30,60μmol/l）SK-N-SH细胞周期无明显变化,高浓度组（90,120μmol/l）G0/G1期细胞比例下降;

（4）免疫组化和RT-PCR测定显示随着CAY10404浓度增加,bcl-2,survivin表达下调,而bax表达上调。

[结论]（1）NB细胞中存在COX-2的高表达,选择性COX-2抑制剂CAY10404对人NB细胞SK-N-SH的增殖有抑制作用,并呈时间和剂量依赖性,其作用可能是通过COX-2依赖性途径实现的;

（2）CAY10404诱导SK-N-SH细胞的凋亡,并引起其细胞周期的重新分布,bcl-2、survivin、bax等凋亡相关基因可能参与了CAY10404诱导的SK-N-SH细胞凋亡过程。

参考文献

[1]Inhibition of human Neuroblastoma in SCID mice by low-dose of selective Cox-2 inhibitor Nimesulide[J].Bhupesh Parashar,Bridget Shafit-Zagardo.Journal of Neuro-Oncology.2006(2)

[2]Risk of acute myocardial infarction and sudden cardiac death in patients treated with cyclo-oxygenase 2 selective and non-selective non-steroidal anti-inflammatory drugs:nested case-control study[J].David J Graham,David Campen,Rita Hui,Michele Spence,Craig Cheetham,Gerald Levy,Stanford Shoor,Wayne A Ray.The Lancet.2005(9458)

[3]Survivin,a novel anti-apoptosis inhibitor,expression in uterine cervical cancer and relationship with prognostic factors[J].J.-P.LEE,K.-H.CHANG,J.-H.HAN,H.-S.RYU.International Journal of Gynecological Cancer.2005(1)

[4]Inhibition of human neuroblastoma cell growth by CAY10404,a highly selective Cox-2 inhibitor[J].Bhupesh Parashar,Sai Latha Shankar,Kathleen O’Guin,James Butler,Bhadrasain Vikram,Bridget Shafit-Zagardo.Journal of Neuro-Oncology.2005(2)

[5]孙祥伦.选择性环氧合酶-2抑制剂CAY10404抑制人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH生长的体外实验研究[D].安徽医科大学,2007.