质粒DNA小量提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

质粒DNA小量提取试剂盒品将磁性纳米分离技术和细菌细胞的SDS碱裂解法结合从菌体中提取高质量的质粒DNA。在离心力的作用下细胞碎片和SDS复合物沉淀下来。在一定的条件下磁珠能很好的吸附存在于上清中的质粒DNA，其他杂质如蛋白质、盐离子等通过洗涤被除去。当条件改变时，磁珠释放吸附的质粒DNA。

对于高拷贝质粒，从2 ml过夜培养的菌液（OD600=2.0）中可以获得超过15μg的质粒DNA。由本试剂盒抽提得到的质粒纯度高，OD260/OD280比值一般为1.8-1.9之间，OD260/OD230比值大于2.0，可直接用于转化、DNA测序、PCR和酶切等后续实验。

使用本试剂盒提取质粒DNA具有如下特点：高得率、高纯度，无须使用苯酚、氯仿等有毒试剂。1-5ml过夜培养的大肠杆菌中可快速提取多达20μg纯净质粒，提取的质粒DNA可直接用于限制性酶切反应、PCR、转化、体外转录、测序等多种分子生物学实验。

质粒DNA小量提取试剂盒

标准抽提步骤：

1.在含合适抗生素的培养基中接种目标菌株，于37℃摇床充分振荡培养12-16 h。

2.对于高拷贝质粒，取1-2 ml菌液，室温10,000 rpm离心2 min收集菌体，吸净上清。

3.向菌体沉淀中加入200μl Buffer MP1，吸打或振荡至彻底悬浮菌体。

4.加入250μl Buffer MP2，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置3-5 min至完全裂解。

5.加入200μl Buffer MP3，立即温和颠倒离心管5-10次充分混匀。

6.于离心机转速（≥12,000 rpm）离心5-10 min，小心吸取600μl上清并转移至新的1.5 ml离心管中，然后向上清液中加入与上清等体积的Buffer MPB和25μl PureMag Beads，温和吸打混匀，室温静置1 min。

7.将离心管置于磁力架上5 min，待PureMag Beads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管。

8.向离心管中加入900μl 70%乙醇，缓慢吸打混匀，将离心管置于磁力架上1min，待PureMag Beads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。

9.重复步骤8一次，室温开盖干燥15-20 min或者55℃恒温箱中开盖干燥5-7 min至管内无液体残留。

10.加入50-100µl的TE Buffer（pH8.0），65℃水浴5-10 min，间或混匀。

11.取出离心管并置于磁力架上1min，待PureMag Beads完全吸至管壁上之后，吸取上清至新的离心管，即获得纯的质粒DNA。

应用^[4][5]

用于单增李斯特菌质粒DNA定性标准物质的研制及在银耳检测中的应用研究

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）,是一种常见食源性病原菌,是李斯特菌属中致病力最强的革兰氏阳性无芽孢杆菌,可引发多种疾病,致死率高（20%～30%）,在熟食、水产产品、冷冻食品及食用菌中均有检出,因此快速检测和诊断单增李斯特菌对食品安全意义重大。但食源性致病菌的传统检测方法耗时长、检测限低,不利于致病菌的快速检测。

通过提取单增李斯特菌标准菌株全基因组DNA,以此作为模板对毒力基因引物hly A、prfA1、prfA2进行PCR扩增,回收这3种毒力基因扩增的目的片段;分别克隆至载体p LB-simple Vector中,构建分别含有对应毒力基因的重组质粒;通过菌落PCR和测序对重组质粒进行检验,将转化成功的重组质粒进行质粒提取并保存,大量提取质粒进行冻干,制成冻干粉,即初步得到用于检测单增李斯特菌的质粒标准品。

根据菌落PCR和测序验证结果显示,本研究成功构建出含有hly A、prfA1、prfA2毒力基因的质粒标准物质,浓度、纯度和稳定性均达到要求。且在长期稳定性实验检测中,质粒标准物质的稳定性良好。同时发现PCR的敏感性受靶基因的影响,不同毒力基因的检测限也不同。

将构建含有hly A、prf A1、prfA2毒力基因的质粒标准品作为阳性对照用于对30批次银耳样品的检测,有1批样品检测出prfA1和prfA2,检出率为3.3%。并对检测结果呈阳性的银耳样品通过传统微生物检测方法验证,但传统检测方法没有获得目标菌株,可能是在环境胁迫或优势菌株的存在下,目标菌株进入休眠或是VBNC状态。此种状态下的菌株在传统检测方法下不易被检出,大大降低了检出率,同时说明了PCR方法的灵敏度高于传统检测方法。

参考文献

[1]Combined Enrichment and Quantitative Polymerase Chain Reaction to Improve Sensitivity and Reduce Time of Detection of Listeria monocytogenes in Mushrooms.[J].Lee Yewon,Yoon Yohan,Seo Yeongeun,Kim Sejeong,Ha Jimyeong,Lee Jeeyeon,Choi Yukyung,Oh Hyemin,Kim Yujin,Kang Joohyun,Park Eunyoung,Kim Won-Il,Lee Soomin.Foodborne pathogens and disease.2020(4)

[2]Listeria monocytogenes and other Listeria species in raw milk and sausage in East Algeria[J].L.Benhalima,T.Merad,M.Bensouilah,R.Ouzrout.Asian Journal of Dairy and Food Research.2019(1)

[3]The European Union summary report on trends and sources of zoonoses,zoonotic agents and food‐borne outbreaks in 2017[J].EFSA Journal.2018(12)

[4]Antimicrobial mechanism of clove oil on Listeria monocytogenes[J].Haiying Cui,Chenghui Zhang,Changzhu Li,Lin Lin.Food Control.2018

[5]马盼盼.单增李斯特菌质粒DNA定性标准物质的研制及在银耳检测中的应用[D].河南大学,2020.