NCI-N87人胃癌细胞的应用

背景^[1-3]

NCI-N87人胃癌细胞是源于肝转移胃癌的上皮细胞样贴壁细胞系，NCI-N87细胞表达表面糖蛋白癌胚抗原(CEA)和TAG 72,并且没有左旋多巴胺脱羧酶(DDC)活性。它们的血管活性的肠肽(VIP)受体活性极低并缺乏胃泌激素受体。它们表达蕈毒碱胆碱受体。没有证据表明存在N-myc,L-myc,myb和EGF受体基因的重组。这个细胞株表达的c-myc和c-erb-B 2 RNA水平与其它细胞株相当。以下基因不表达:N-myc,L-myc,c-cis,IGF-2,或胃泌激素释放肽。

NCI-N87人胃癌细胞

细胞培养步骤

培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于顺铂致胃癌细胞NCI-N87损伤的差异miRNA表达谱分析及潜在机理研究

基于小RNA高通量测序技术研究顺铂处理胃癌细胞NCI-N87后差异miRNAs表达谱变化,并结合双荧光素酶报告基因系统和细胞功能实验研究差异表达miRNAs潜在调控靶点,进而揭示其潜在的作用机理。

方法首先采用梯度浓度顺铂处理人源胃癌细胞NCI-N87,采集细胞图片并结合MTT法测定细胞增殖活性以筛选获得顺铂致胃癌细胞NCI-N87损伤的顺铂浓度。其次,基于上述筛选的顺铂浓度处理胃癌细胞,收集细胞后进行小RNA高通量测序及生物信息学分析获得差异表达miRNAs,并进行热图和火山图分析。基于上述差异miRNAs表达谱筛选5个显著上调miRNAs和5个显著下调miRNAs进行实时荧光定量PCR验证。

针对验证与高通量测序一直的miRNAs采用TargetScan和miRDB靶基因预测软件进行靶基因预测,并利用R语言包绘制Venn图,针对上述两个软件获得的交叉靶基因进行GO和KEGG聚类分析,并利用Cytoscape软件进行交叉调控网络构建。针对miRNAs调控的靶基因筛选获得靶基因的3′-UTR区,构建双荧光素酶报告基因载体,测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性,取二者比值获得miNRAs调控靶基因的体外活性。

体外合成双荧光素酶报告基因系统验证的miRNAs模拟物Mimic和抑制子Inhibitor,转染顺铂处理的胃癌细胞NCI-N87,分别采用MTT法测定细胞增殖活性,流式细胞术测定细胞周期和细胞凋亡,Transwell小室测定细胞迁移&侵袭。

结果1)当顺铂浓度达到15μg/ml时,对胃癌细胞NCI-N87的损伤已接近50%。从采集的细胞图片看,在此浓度下对胃癌细胞NCI-N87造成一定的损伤,但仍有50%以上的细胞状态较好。因此,后续确定顺铂致胃癌细胞NCI-N87损伤的浓度为:15μg/ml。

2) 与对照组相比,顺铂处理后,胃癌细胞NCI-N87中共获得49个显著差异表达miRNAs,包括33个显著上调miRNAs和16个显著下调miRNAs。

3) 与对照组相比,顺铂处理后hsa-miR-1246的表达水平显著上调,hsa-miR-892b的表达水平显著下调。

4) 基于TargetScan和miRDB数据库靶基因预测分析发现,hsa-miR-1246在两个数据库中的交叉调控基因共计196个,hsa-miR-892b在两个数据库中的交叉调控基因共计323个。

进一步地,根据交叉调控基因进行GO功能聚类和KEGG信号通路聚类分析发现,hsa-miR-1246调控的靶基因共参与30个包含生物过程、细胞组成和分子功能的过程和3个KEGG信号通路,hsa-miR-892b调控的靶基因共参与29个包含生物过程、细胞组成和分子功能的过程和11个KEGG信号通路,二者均具有复杂的交叉调控网络。

参考文献

[1]Immunotherapy in advanced gastric cancer,is it the future?[J].C.Coutzac,S.Pernot,N.Chaput,A.Zaanan.Critical Reviews in Oncology/Hematology.2019

[2]Mapping mammalian replication domains using the ion torrent semiconductor sequencing platform[J].Takebayashi,Ogata,Ogata,Okumura.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry.2018(12)

[3]Caffeic acid phenethyl ester potentiates gastric cancer cell sensitivity to doxorubicin and cisplatin by decreasing proteasome function[J].Toshiyuki Matsunaga,Saeka Tsuchimura,Nozomi Azuma,Satoshi Endo,Kenji Ichihara,Akira Ikari.Anti-Cancer Drugs.2018

[4]A Novel Mutation of Aryl Hydrocarbon Receptor Interacting Protein（AIP）Gene Associated With Familial Isolated Pituitary Adenoma（FIPA）Mediates Tumor Invasion and Growth Hormone Hypersecretion[J].Feng Cai,Yuan Hong,Jinghong Xu,Qun Wu,Cesar Reis,Wei Yan,Wei Wang,Jianmin Zhang.World Neurosurgery.2018

[5]尹纯林.顺铂致胃癌细胞NCI-N87损伤的差异miRNA表达谱分析及潜在机理研究[D].安徽医科大学,2019.DOI:10.26921/d.cnki.ganyu.2019.000010.