人骨髓间充质干细胞分离液的应用

背景^[1-3]

人骨髓间充质干细胞分离液用于人骨髓间充质干细胞的分离，主要用于人骨髓间充质干细胞的原代培养等研究。目前常用的分离hMSCs的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞在低血清培养基中有贴壁优势特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化及扩增MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中各细胞成分比重的不同，分离单核细胞进行贴壁培养。二者本质上无多大区别。随着对MSC表面抗原认识的深入，又有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化。但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之成本较高和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

人骨髓间充质干细胞

人骨髓间充质干细胞分离培养方法：

(1)无菌条件下抽取骨髓液5mL，用等体积PBS稀释混匀，室温下1500rpm离心10分钟；

(2)弃去脂肪层，将稀释骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积Ficoll分离液（1.077g/mL）上面，室温2500rpm离心30分钟；

(3)吸取界面白膜状层的单个核细胞，用PBS混悬后，室温1500rpm离心10分钟；

(4)弃上清并重复洗涤2次。

(5)用含10%FBS的LG—DMEM培养液（或骨髓间充质干细胞专用培养基）重悬细胞，调整细胞密度为2x105/mL，接种于底面积为25cm2培养瓶中置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养；

(6)于3天后首次换液，弃去悬浮细胞后，每2-3天换液一次；

(7)每日镜下观察细胞形态及生长变化，待细胞生长达80%-90%融合时，用胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%:0.02%）进行消化，按1：2比例进行传代培养。

应用^[4][5]

用于人骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定研究

建立人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）体外分离、培养及扩增的方法,观察MSCs体外培养增殖的生物学特性,并应用流式细胞术,检测细胞表型,分析鉴定MSCs的纯度。

方法：（1）无菌条件下抽取骨髓液5mL,用等体积PBS稀释混匀,室温下1500rpm离心10分钟,弃去脂肪层,将稀释骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积Ficoll分离液（1.077g/mL）上面,室温2500rpm离心30分钟,吸取界面白膜状层的单个核细胞。用PBS混悬后,室温1500rpm离心10分钟,弃上清并重复洗涤2次。用含10%FBS的LG—DMEM培养液重悬细胞,调整细胞密度为2x105/mL,接种于底面积为25cm2培养瓶中置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。3天后首次换液,弃去悬浮细胞后,每2-3天换液一次。每日镜下观察细胞形态及生长变化,待细胞生长达80%-90%融合时,用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（1:1,V/V）进行消化,再按1：2比例进行传代培养,共传代三次。

（2） MSCs的生长曲线测定：取P3细胞,按5×104/mL浓度接种于24孔培养板培养,每天取3孔,计算平均值,连续培养8天,采用血球计数板计数法,绘制生长曲线。

（3） 贴壁率测定：取P3细胞,按5×104/mL浓度接种于25cm2培养瓶内培养,每2小时取2瓶,消化计数,计算贴壁率,绘制贴壁率曲线。

（4） MSCs的表型鉴定：取P3细胞,将细胞消化吹打制成单细胞悬液,1500rpm离心5分钟,弃去上清液,用PBS重复洗涤后,调整细胞浓度为5×106/mL,各取细胞悬液100μL,分别滴加荧光标记抗人CD34-PE、CD44-FITC、CD29-PEcy5.5、CD105-FITC、HLA-DR-PE抗体10μL,4℃避光孵育30分钟,PBS洗涤后应用流式细胞仪进行检测,确定MSCs的表面标志物的表达情况。

结果：MSCs属于骨髓中的单个核细胞,采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合可以有效分离、纯化人骨髓MSCs。细胞形态观察：细胞初接种入培养瓶时为圆形的单个核细胞,大小不一,与周围的血细胞相互混杂。

培养24小时后,细胞开始出现贴壁,48-72小时细胞贴壁逐渐增多,72小时首次换液后,可见少量分散的短梭形及不规则多角形的初始贴壁细胞。第4-8天细胞生长快,呈集落样生长,可见有粗大的突起伸出,细胞形态呈梭形。第10-12天后细胞克隆进一步扩大,呈大的长梭形,培养至第14-16天时贴壁细胞可达80%～90%融合,大量贴壁细胞呈长梭状成纤维细胞样形态并列或呈漩涡状排列。

传代细胞刚接种时为圆形,较大,24小时内能完全贴壁,伸展呈梭形,增殖迅速,5-7天细胞融合可达90%。细胞形态均匀,与成纤维细胞形态相似,大部分呈长梭状,排列规则。

参考文献

[1]Bone marrow stromal cells as replacement cells for Parkinson’s disease:generation of an anatomical but not functional neuronal phenotype[J].Meghan G.Thomas,Leah Stone,Lauren Evill,Syerna Ong,Mel Ziman,Livia Hool.Translational Research.2011(2)

[2]Bone marrow-derived mesenchymal stem cells modulate BV2 microglia responses to lipopolysaccharide[J].Yin Yin Ooi,Rajesh Ramasamy,Zul’atfi Rahmat,Hemavathy Subramaiam,Shi Wei Tan,Maha Abdullah,Daud Ahmad Israf,Sharmili Vidyadaran.International Immunopharmacology.2010(12)

[3]Development and introduction of production standards for cell products of mesenchymal origin[J].V.V.Burunova,Yu.G.Suzdaltseva,A.V.Voronov,I.B.Cheglakov,I.V.Vakhrushev,K.N.Yarygin,V.N.Yarygin.Bulletin of Experimental Biology and Medicine.2008(4)

[4]Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood[J].AlejandroErices,PauletteConget,JoséJ.Minguell.British Journal of Haematology.2008(1)

[5]卢小媚.人骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定[D].扬州大学,2013.