阪崎肠杆菌概述及其检测方法

背景及概述^[1][2]

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazalii)是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)肠杆菌属(Enterobacter ) 成员之一。虽然该菌并不常见，但其是能引起新生儿脑膜炎的危险性较大的一种病原菌。该菌为革兰氏阴性、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大小为(0.3～1.0)μm×(1.0～6.0)μm。最适生长温度为37℃。具有运动性，过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性，发酵多种糖类产酸产气。吲哚和甲基红实验阴性，VP实验阳性。其抵抗力较弱，通常巴氏杀菌就能够杀死，但是有时在超高温灭菌(UHT)乳和乳粉中发现有该菌污染。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。阪崎肠杆茵的生物学性状及其对人群的健康危害受到人们的关注并被报告。

阪崎肠杆菌是奶粉(乳)制品中新发现的一种致病菌。由其引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40％～80％。阪崎肠杆菌已引起世界多国相关部门的重视。据报道，国外乳业巨头曾因此被召回。在美国FDA2002年在本土某一些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌后，2003年又一家国际乳业巨头公司主动召回在美国生产的一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉，阪崎肠杆菌从此成为世界瞩目的焦点。

检测^[2]

一、一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法。

步骤包括：

(1)向待测样品中加入免疫化超顺磁纳米粒子，15～35℃混合反应10～60min，使免疫化超顺磁纳米粒子与阪崎肠杆菌发生特异性结合；

(2)在外加磁场吸引作用下，收集免疫化的超顺磁纳米粒子，洗涤后加入免疫化荧光量子点，15～35℃混合反应10～60min，使之与载于免疫化超顺磁纳米粒子的致病微生物阪崎肠杆菌发生特异性结合；

(3)利用外加磁场吸引作用下收集载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌与免疫化荧光量子点结合物，洗涤后定性或定量荧光检测；

本方法首先制备具有超顺磁性的四氧化三铁纳米粒子，在纳米粒子表面包裹二氧化硅，然后表面修饰氨基，使之能与抗体结合，具有生物相容性。然后将特异性的抗体偶联在磁性颗粒表面，使之能与样品中被检微生物食源性致病菌阪崎肠杆菌发生特异性结合。载有致病微生物阪崎肠杆菌的免疫化超顺磁纳米粒子在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，利用外加磁场(2000～6500Gs)吸附磁性粒子收集上述免疫化超顺磁纳米粒子，弃去检样混合液；在此基础上，将被特异性抗体偶联的免疫化荧光量子点加入到浓集后的反应体系中，使之与载于磁性颗粒的致病微生物阪崎肠杆菌发生特异性结合。提供外加磁场，被载于磁性颗粒并且偶联有荧光量子点的目标微生物阪崎肠杆菌向磁极方向聚集，弃去检样混合液，利用外加磁场(2000～6500Gs)吸附磁性粒子收集磁性粒子，可进行荧光定性定量检测。

若样品中含有阪崎肠杆菌，通过上述方法，可将免疫化的荧光量子点(间接)连接到免疫化超顺磁纳米粒子，经过磁性收集，进行荧光检测；复合物结构：免疫化荧光量子点-阪崎肠杆菌-免疫化超顺磁纳米粒子。本方法不仅能从各种样本中迅速分离目标菌，同时加以高效富集，且分离后的细菌经快速的荧光标记，既能通过荧光显微镜定性鉴定，又能被荧光分光光度计定量的检测。整个检测过程仅需2个小时，操作方便、简单，可靠性好，对配套设备要求低。

二、阪崎肠杆菌的分子检测方法

采用单引物等温扩增方法，以SYBER GreenⅡ 为荧光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号，即以实时荧光定量PCR检测扩增信号，具体过程包括如下步骤：

（1）取含阪崎肠杆菌的待检样品，提取基因组DNA；

（2）建立阪崎肠杆菌的实时荧光单引物等温扩增的25 μL反应体系：其中RNA/DNA组合引物为2.8μmol/L、Blocker为0.2 μmol/L、Mg²⁺为5.0 mmol/L、dNTPs为1.0 mmol/L、BST DNA聚合酶为20U、RNase H酶为2.5U、RNase Inhibitor为32U、SYBER GreenⅡ为0.3μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；所述SYBER GreenⅡ为300倍稀释；将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至 60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上55℃反应40min，反应过程中实时监测荧光信号；

（3）检测分析：分析检测数据；所述引物选用GGUCCGAC-TCACGAAAGCC 5’端8nt碱基为RNA序列，3’端11nt碱基为DNA序列；Blocker选用CGACGACCACGACA ，3’端用生物素修饰，中间随机加上两个IXNA修饰。本检测方法可用于婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌检测。

主要参考资料

[1] 现代乳品工业手册

[2]CN201010165329.5 一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法

[3]CN201410803701.9 一种阪崎肠杆菌的分子检测方法及其应用