RIN-M5F细胞的应用

背景^[1-3]

RIN-M5F细胞是大鼠胰岛细胞RIN-m的克隆，分泌胰岛素及L型多巴脱羧酶；RIN-m5F细胞不产生生长激素抑制激素。

原代细胞培养：

1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。

2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。

3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。

4.将筛网置于平皿中，脾Chemicalbook脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。

5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。

6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。

7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。

RIN-M5F细胞

细胞操作方法：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。对于贴壁细胞，传代方法：1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶Chemicalbook中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

用于γ-氨基丁酸对RIN-m5f细胞的保护作用及机制探究

拟建立高糖（G）和H2O2氧化损伤RIN-m5f细胞模型，以探讨GABA对胰岛β细胞抗氧化调节作用及其作用机制。

方法：分别采用11mM、22mM、44mM G孵育RIN-m5f细胞48h，以及10μM、50μM、100μM H2O2孵育1h建立体外氧化损伤细胞模型。GABA干预实验分为：对照组（11mM G）、损伤组（G/H2O2）、GABA组（G/H2O2+GABA）、硫辛酸组（G/H2O2+LA）。采用DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平；检测细胞氧化还原状态指标和胰岛素分泌水平；MTT法测定细胞存活率；流式细胞术检测细胞凋亡线粒体膜电位；RT-PCR法检测与抗氧化、抗凋亡和胰岛素分泌相关基因mRNA表达水平；Western blot法检测Nrf2和GSK-3β蛋白水平、p-GSK-3β（Ser9）和p-GSK-3β（Tyr216）磷酸化水平。

结果：随着G和H2O2浓度的增加，胞内ROS和MDA水平显著提高（P<0.05），且GAD1mRNA表达水平极显著下调（P<0.01），细胞均出现不同程度的氧化损伤（P<0.05）；添加100μM和200μM GABA可显著降低胞内ROS和MDA水平（P<0.05），提高T-AOC、GSH-Px、CAT、SOD活力，上调抗氧化及抗凋亡相关基因Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2mRNA表达水平（P<0.05），提高细胞线粒体膜电位和存活率（P<0.05）；此外，GABA可显著提高胰岛素合成相关基因（INS-2、Pdx-1、MafA、GK、GLUT2、Gabra2）mRNA表达水平（P<0.05），促进胰岛素分泌释放。

Western blot结果显示，GABA显著抑制氧化损伤细胞（44mM G和100μM H2O2）GSK-3β蛋白水平（P<0.05），显著提高p-GSK-3β（Ser9）磷酸化水平和Nrf2核质比例（P<0.05），但对p-GSK-3β（Tyr216）磷酸化水平无显著性影响（P>0.05）。

结论：GABA可显著增强氧化损伤（G和H2O2）RIN-m5f细胞抗氧化能力，提高细胞存活率和胰岛素合成分泌，具有抗凋亡作用；GABA可调节胞内GSK-3β/Nrf2通路相关基因mRNA表达水平，显著提高Nrf2核质比例，增强细胞抗氧化能力，其作用机制可能与提高p-GSK-3β（Ser9）磷酸化水平、降低GSK-3β蛋白水平有关；GABA抗氧化调节作用具有浓度依赖效应，即随着氧化损伤程度的增加，GABA需要量增加。

参考文献

[1]Therapeutic potential of pterostilbene against pancreatic beta‐cell apoptosis mediated through N rf2[J].Elango Bhakkiyalakshmi,Devibalan Shalini,Thillai Veerapazham Sekar,Palanisamy Rajaguru,Ramasamy Paulmurugan,Kunka Mohanram Ramkumar.Br J Pharmacol.2014(7)

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[3]Mitochondrial permeability transition in Ca 2+-dependent apoptosis and necrosis[J].Andrea Rasola,Paolo Bernardi.Cell Calcium.2011(3)

[4]Oxidative stress and diabetes:What can we learn about insulin resistance from antioxidant mutant mouse models?[J].JennaLynn Styskal,Holly Van Remmen,Arlan Richardson,Adam B.Salmon.Free Radical Biology and Medicine.2011(1)

[5]蔺忆.γ-氨基丁酸对RIN-m5f细胞的保护作用及机制探究[D].江南大学,2014.