MDCK犬肾细胞的应用

背景^[1-3]

MDCK犬肾细胞是由S·H·Madin和N·B·Darby在1958年9月从一只外观正常的成年雌性英国小猎犬的肾分离得到的；MDCK(NBL-2)细胞角蛋白免疫过氧化物酶染色呈阳性；MDCK(NBL-2)细胞被用于研究β-粥样蛋白前体的处理及其蛋白水解产物。

MDCK犬肾细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；+1%Glutamax+1%Sodium Pyruvate，双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于H3N2犬流感病毒的HA突变株构建及其与伪中间葡萄球菌的体外共感染研究

以A/canine/Jiangsu/06/2010（H3N2）完整的8个基因片段作为骨架,探讨HA L222W和HA R326K位点突变对CIV传播和毒力的影响;同时利用犬流感病毒、伪中间葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius,Sp）和犬肾细胞（Madin-Darby canine kidney,MDCK）,建立并优化了病毒-细菌体外细胞共感染模型,研究CIV的预感染对伪中间葡萄球菌继发感染的作用。

1 H3N2亚型犬流感病毒HA片段定点突变株的构建为了研究H3N2亚型犬流感病毒HA蛋白222位和326位氨基酸在病毒感染中的作用,利用定点突变方法分别构建了pBD-HA、pBD-HAL222W、pBD-HAR326K、pBD-HA L222W+R326K重组质粒。利用八质粒反向遗传操作系统,将A/canine/Jiangsu/06/2010（H3N2）江苏分离株除HA片段以外的7个基因片段的重组质粒,分别与pBD-HA、pBD-HAL222W、pBD-HAR326K、pBD-HAL222W+R326K重组质粒共同转染MDCK和293T细胞,成功拯救出4株病毒,分别命名为r-06、r-06/L222W、r-06/R326K、r-06/L222W+R326K。4株病毒经过连续8次传代及基因测序,确认了该4株病毒可以稳定遗传。

2 H3N2亚型犬流感病毒HA片段定点突变株的特性分析为了研究HAL222W、HA R326K位点突变对于A/canine/Jiangsu/06/2010（H3N2）流感病毒复制能力和致病性的影响,对构建的犬流感病毒r-06/HA及r-06/HA L222W、r-06/HAR326K、r-06/HAL222W+R326K突变株进行体外细胞感染试验和小鼠体内感染试验。蚀斑形成试验和MDCK细胞上生长曲线结果显示:与r-06/HA相比,3株定点突变病毒的蚀斑更大,出现蚀斑时间更短并且滴度峰值更高,且引起更多的细胞凋亡。但是MDBK细胞上的生长曲线显示:在24h时,r-06/HA的病毒滴度显著高于r-06/HA L222W和r-06/HA L222W+R326K（P<0.001）。小鼠试验结果显示:突变株与r-06/HA相比,体重下降更多、肺脏病毒载量更高。但无论是体外还是体内试验,r-06/HA L222W+R326K的结果均介于r-06/HA与r-06/HA L222W、r-06/HA R326K之间。鸡红细胞结合和释放试验证实r-06/HA L222W+R326K影响了HA和NA的平衡。

3 H3N2亚型犬流感病毒与伪中间葡萄球菌对犬肾细胞的体外共感染为了研究犬流感病毒与伪中间葡萄球菌对犬肾细胞的共感染作用,利用犬流感病毒（CIV）、伪中间葡萄球菌（Sp）和犬肾细胞（MDCK）,建立并优化了病毒-细菌体外细胞共感染模型。试验分4组:病毒单独感染组（CIV）、细菌单独感染组（Sp）、感染病毒后12h再感染细菌组（CIV/Sp）及空白对照组（C）。结果显示:病毒感染后24h,CIV/Sp组的细胞毒性为39.7%,极显著高于CIV组和Sp组（P<0.001）;CIV/Sp组病毒RNA载量显著低于CIV组（P<0.001）。细菌黏附和侵袭试验表明:细菌感染后4h,CIV/Sp的黏附和侵袭量极显著高于Sp组（P<0.001）,侵袭量升高20倍。细菌感染后6h,CIV/Sp组IL-6、TNF-α的表达量均极显著高于其他3组（P<0.001）。

参考文献

[1]Impacts of different expressions of PA-X protein on 2009 pandemic H1N1 virus replication,pathogenicity and host immune responses[J].Jinhwa Lee,Hai Yu,Yonghai Li,Jingjiao Ma,Yuekun Lang,Michael Duff,Jamie Henningson,Qinfang Liu,Yuhao Li,Abdou Nagy,Bhupinder Bawa,Zejun Li,Guangzhi Tong,Juergen A.Richt,Wenjun Ma.Virology.2017

[2]Expected and Unexpected Features of the Newly Discovered Bat Influenza A-like Viruses[J].Wenjun Ma,Adolfo García-Sastre,Martin Schwemmle.PLOS Pathogens.2015(6)

[3]Influenza A virus infection of vascular endothelial cells induces GSK-3β-mediatedβ-catenin degradation in adherens junctions,with a resultant increase in membrane permeability[J].M.Hiyoshi,I.L.Indalao,M.Yano,K.Yamane,E.Takahashi,H.Kido.Archives of Virology.2015(1)

[4]Could A Deletion in Neuraminidase Stalk Strengthen Human Tropism of the Novel Avian Influenza Virus H7N9 in China,2013[J].Chen,Liang,Zhu,Feng,Xiong,Chenglong,Zhang,Zhijie,Jiang,Lufang,Chen,Yue,Zhao,Genming,Jiang,Qingwu.International Journal of Environmental Research and Public Health.2015(1)

[5]梁姗.H3N2犬流感病毒的HA突变株构建及其与伪中间葡萄球菌的体外共感染[D].南京农业大学,2017.