SUBSTANCE P P物质抗体的应用

背景^[1-3]

SUBSTANCE P P物质抗体是一类可以特异性结合SUBSTANCE P P物质的一类多克隆抗体，主要用于体外SUBSTANCE P P物质的免疫学检测。

物质-P(substance-P)又称P物质，是一种神经肽。肽序列为Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met。分布在神经组织，是在脑、下丘脑、脊髓中含量最高的突出颗粒的肽类神经递质。SUBSTANCE P P物质在平滑肌收缩，刺激唾液也都要分布，SUBSTANCE P P物质有血管舒张和降低血压等作用，SUBSTANCE P P物质也可以用于癌等疾病的诊断。

SUBSTANCE P P物质免疫组化

近年来,P物质（substance P,SP）及其受体（NK-1 receptor,NK-1R）介导的神经源性炎症越来越受到重视,SP与其受体结合后,通过激发免疫细胞浸润和细胞因子释放的瀑布式级联反应在疼痛、肝炎、心肌炎、胆汁淤积、菌血症、病毒感染等病理生理过程中发挥重要作用。此外,SP及其受体同样参与了血管的形成、肿瘤细胞的增殖、迁移及影响抗凋亡效应。

研究表明,阻断肝脏传入神经或SP受体,可有效降低肝脏损伤的炎症反应,如水肿的形成、粒细胞的浸润、以及抑制肿瘤坏死因子（TNF-α）、干扰素（IFN-γ）的生成,同时,可促进肝细胞保护因子如白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）的合成而抑制肝细胞凋亡、坏死而发挥肝细胞保护作用。由于SP受体阻断剂不仅可以抑制各种炎症因子的释放,还同时具有抗肝细胞凋亡的作用,因此,SP受体阻断剂很有希望成为抑制肝纤维化的潜在药物。

应用^[4][5]

用于神经肽P物质对大鼠肝纤维化及肝星状细胞活化的作用及机制研究

SP可促进肝脏库普弗细胞（Kupffercells,KCs）表达NK-1R受体,同时促进肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的释放而在小鼠免疫性肝损伤中发挥重要作用。然而,SP是否参与了肝纤维化,尤其是否与HSC激活及持续活化有关,至今仍不清楚。鉴于此,本=实验研究了SP对肝星状细胞活化、增殖及对肝纤维化的影响,并初步探讨其内在作用机制。

SP对大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞增殖、活化及凋亡的影响目的:检测系列浓度的SP在不同的处理时间下对大鼠HSC-T6细胞增殖的影响,同时利用油红染色检测系列浓度SP对HSC-T6细胞活化的影响以筛选出SP作用浓度。在此基础上,应用NK-1R受体阻滞剂（L732138）共处理细胞,并检测SP/NK-1R受体阻滞剂对HSC-T6细胞凋亡的影响,并行western-blot检测HSC-T6细胞活化相关蛋白表达变化,以评估SP/NK-1R受体阻滞剂对肝星状细胞增殖、活化及凋亡的影响。

方法:1.使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基常规培养HSC-T6细胞,应用系列浓度的SP（10、50、100、500、1000、5000 nM）分别作用HSC-T6细胞6/12 h,行MTT/LDH检测细胞活性。

2. 系列浓度的SP（10、50、100、500、1000、5000 nM）处理HSC-T6细胞,行油红染色、western-blot检测HSC活化蛋白α-SMA/CollagenⅠ表达变化。

3. 应用NK-1R受体阻滞剂L732138与SP共培养HSC-T6细胞,行MTT/LDH检测细胞活性,油红染色,western-blot检测α-SMA/CollagenⅠ蛋白水平,评估对HSC-T6活化的影响。

4. Hoechst33342/PI双染,流式细胞术检测SP及L732138对HSC-T6细胞凋亡的影响。

结果:1.系列浓度的SP（10-5000 nM）处理细胞6 h,MTT/LDH检测显示各浓度组无明显差异。12h时,500/1000nMSP均可明显升高MTT值并降低LDH的释放。

2. 油红染色显示500/1000 nMSP可明显促进HSC-T6细胞脱脂滴,western-blot检测示500/1000 nM SP促进α-SMA/CollagenⅠ蛋白表达。

3. NK-1R阻滞剂L732138可显著抑制SP对HSC-T6细胞增殖的促进作用,并抑制SP引起的HSC-T6脱脂滴,及α-SMA/CollagenⅠ蛋白表达的上调。

4. 凋亡相关检测显示,500/1000nMSP抑制HSC-T6细胞的凋亡,该作用可被NK-1R受体阻滞剂L732138阻滞。

结论:1.较低浓度（10-100nM）的SP在较短作用时间内（6h）对HSC-T6细胞活性无明显影响,500/1000 nM SP作用HSC-T6细胞12 h,可明显促进HSC-T6细胞活性,抑制凋亡并促进HSC-T6细胞活化。

2.NK-1R受体阻滞剂L732138可抑制SP对HSC-T6细胞活性、增殖及活化的促进作用,并促进HSC-T6细胞的凋亡,表明在体外实验中,L732138至少可部分抑制SP对肝纤维化的促进作用。

参考文献

[1]DHEA-induced ovarian hyperfibrosis is mediated by TGF-βsignaling pathway.[J].Wang Daojuan,Wang Wenqing,Liang Qiao,He Xuan,Xia Yanjie,Shen Shanmei,Wang Hongwei,Gao Qian,Wang Yong.Journal of ovarian research.2018(1)

[2]Antioxidant,antiapoptotic and amino acid balance regulating activities of 1,7-dihydroxy-3,4,8-trimethoxyxanthone against dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis.[J].Zheng Xi-Yuan,Zhao Xin,Yang Ying-Fan,Jiang Han-Jie,Li Wan,Sun Yi,Pu Xiao-Ping.PloS one.2017(12)

[3]Substance P promotes hepatic stellate cell proliferation and activation via the TGF-β1/Smad-3 signaling pathway[J].Lei Peng,Xiaoqing Jia,Jianjian Zhao,Ruibing Cui,Ming Yan.Toxicology and Applied Pharmacology.2017

[4]Current and upcoming pharmacotherapy for non-alcoholic fatty liver disease[J].Yaron Rotman,Arun J Sanyal.Gut.2017(1)

[5]彭雷.神经肽P物质对大鼠肝纤维化及肝星状细胞活化的作用及机制研究[D].山东大学,2018.