沙门氏菌的新型检测方法

背景及概述^[1][2]

沙门氏菌是一大属具有共同特性的肠道杆菌。因美国病理学家沙门(Daniel Elmer Salmon，1850—1914)最早发现，故名。有数千种，按抗原成分可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组，除伤寒和副伤寒甲、乙杆菌引起人类疾病外，大多仅能引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，但有时人食入此菌污染的食物也可引起食物中毒。沙门氏菌属致食物中毒者，主要有猪霍乱杆菌、鼠伤寒杆菌、纽波沙门氏菌等。此类细菌可在水、乳及肉类等食品中生存数月，特别是病死的牲畜肉。但健康的畜禽肠内亦有此种细菌。发病季节多在夏、秋两季。沙门氏菌引起的食物中毒，多由于对带菌的食物加热不够，处理不当而引起。

下图为沙门氏菌结构图解。

检测^[2-4]

在世界各国各类细菌性的食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒高居前列。人畜感染沙门氏菌后可能加重病症或加大死亡率，也可能会降低动物繁殖力，造成巨大的经济损失，并严重威胁人民群众的身体健康和畜牧业的健康发展，对其防治历来是公共卫生的一项重要课题。快速、准确、简便地检测出沙门氏菌,在医疗卫生、食品卫生、动物疫病监测等方面具有重要的意义。

检测沙门氏菌一直以传统检测方法为主，非选择性和选择性增菌、可疑细菌分离等常规方法虽然经典可靠，但程序复杂、十分繁琐，不仅费时费力而且敏感性和特异性较差，漏检率较高。而免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)技术等方法需要使用指定的仪器设备、具备相应的试验条件和技能，难以在基层推广。胶体金标记免疫分析法是近年兴起并快速发展的一种新型分析技术，其特点是快捷简便、成本低、无污染 且无需培训，非常适合现场检测。与ELISA相比，具有显色时间短、无需仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。

一、一种沙门氏菌的检测试纸及其制备方法

CN201610318472.0采用猪霍乱沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌免疫兔制得的兔 抗沙门氏菌多抗血清，研制胶体金试纸条用于临床快速检测。该检测试纸，包括底板，所述底板具有端和第二端，并且沿所述端向第二端的方向，所述底板上依次组 装有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述胶体金垫上含有胶体金标记的沙门氏菌抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和对照线，所述检测线由能与沙门氏菌 结合的沙门氏菌抗体划膜制成，所述对照线由能与沙门氏菌抗体结合的羊抗兔抗体划膜制成。

其中，所述胶体金标记的沙门氏菌抗体通过以下方法制得：取100单位体积的双蒸水煮沸然后加入1单位体积的1％氯金酸溶液，继续煮沸1-10min，然后加入3单位体积的1％的柠檬酸三钠，搅拌至液体颜色由灰色变成黑色再变成紫色，再煮沸至液体颜色变为酒红色，再加双蒸水至100单位体积，获得胶体金溶液；调节胶体金溶液的pH至8.0；在胶体金溶液中加入沙门氏菌抗体至沙门氏菌抗体的浓度为8-11μg/mL(9.6μg/mL)，混匀后加入10％PEG20000至PEG20000的浓度为1％，获得纯化前的胶体金标记的沙门氏菌抗体；将胶体金标记的沙门氏菌抗体以2000r/min，4℃离心20min，弃去沉淀；将上一步所得上清以10000r/min，4℃离心30min，弃去上清；用0.05mol/L的TBS(内含1％BSA，0.05％NaN3)缓冲液溶解沉淀至纯化前的原体 积，重复前两步的离心2～3次，将沉淀溶于1/10TBS(内含1％BSA,0.05％NaN3)中至纯化前原体积，4℃保存备用，获得纯化后的胶体金标记的沙门氏菌抗体。把样品垫放置于胶体金处理液中浸泡30min，37℃烘干。

其中，设置检测线和对照线的硝酸纤维素膜是将沙门氏菌抗体稀释为2mg/mL，羊抗兔抗体稀释为2mg/mL，并分别以1μL/cm的剂量在硝酸纤维素膜上进行划膜，划膜后烘干即得。

用该试纸检测沙门氏菌的方法，其包括以下步骤：

a)对待测样品进行预处理；

b)将预处理获得的待测样品以前述的检测试纸进行检测；

其中，步骤a)为：

a-1)将待测样品匀浆，并加入缓冲蛋白胨水中，混匀后37℃培养8-18h；

a-2)取步骤a-1)培养液1ml-10ml，加入四硫酸钠煌绿增菌液中42℃培养18-24h；

a-3)取步骤a-2)培养液1ml-10ml，加入亚硒酸盐胱氨酸增菌液中37℃培养18- 24h；

本方法建立的沙门氏菌抗原胶体金试纸条具有很强的便捷性和实用性。本方法兼有免疫反应和色谱层析的优点，无需设备、操作简单，时间短、效率高，特异性强、灵敏度高，稳定性较好。与增菌培养基配合使用，即可作为沙门氏菌监测和诊断的常规手段，具有很强的推广和应用价值。目前国外沙门氏菌胶体金试纸条检测灵敏度能达到1.07×10⁷～1.07 ×10⁸cfu/ml，国内试纸条灵敏度可达1.07×10⁶～1.07×10⁷cfu/ml，本实验制备的试纸条灵敏度能达到1.07×10⁷cfu/ml，且特异性良好。在检测时无须样品预处理，可以直接使用前增菌培养基如缓冲蛋白胨水(BPW)、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、四硫酸钠煌绿增菌液 (TTB)等，将增菌后的样品滴加到试纸条的样品区即可。减少了繁琐的试剂稀释、配制等步骤，结果直观易判定，即拆即用，非专业人员也可操作。试纸条4℃或37℃存放5个月,检测结果稳定。通过对实验室周边超市和菜市场的猪肉、鸡肉和鸡蛋等随机采样检测，结果均为阴性，说明市场上抽检的肉样和鸡蛋没有受到沙门氏菌污染。

 二、检测样品中沙门氏菌活菌体的方法

CN201310583375.0提供了一种检测样品中沙门氏菌活菌体的方法，该方法包括：

（1）将能够特异地与沙门氏菌活菌体结合的抗体偶联在磁球上，得到免疫磁球；所述能够特异地与沙门氏菌活菌体结合的抗体不能与死菌体结合；

（2）将免疫磁球与液体形式的待测样品进行混合，得到混合后的物料；混合的条件使得当待测样品中存在沙门氏菌活菌体时，免疫磁球能够特异性地吸附沙门氏菌活菌体；

（3）将所述混合后的物料置于分选磁场中以固定免疫磁球，并洗脱未吸附在免疫 磁球上的物质，得到洗脱后的免疫磁球；

（4）将吸附在免疫磁球上的物质进行提取DNA的操作，得到模板样品；

（5）使用针对所述沙门氏菌活菌体的特异性引物对模板样品进行PCR扩增，并根据 PCR扩增产物中的目的片段的含量判断待测样品中的沙门氏菌活菌体的含量。

三、肉类中沙门氏菌含量的检测方法

CN201610194726提供一种肉类中沙门氏菌含量的检测方法，步骤如下：

1)样品制备，称取适量肉类样品，使用12-15倍的生理盐水均质拍打15-20min，并 在4000-5000rmp下离心分离10-15min，过滤，取上层清液，将残渣再次加入8-10倍的生 理盐水均质拍打15-20min，并在4000-5000rmp下离心分离10-15min，过滤，取上层清液， 合并两次的上层清液，获得上层总液，备用；

2)空白样品制备，称取适量不含沙门氏菌的空白肉类样品，按照步骤1)，获取空白 上层总液，备用；

3)获取八份不同已知浓度的沙门氏菌溶液，取个浓度沙门氏菌菌液用无菌生理 盐水稀释103、104、105、106、107、108倍，各取200μL沙门氏菌的稀释液分别注入到12 个培养皿中(每个稀释倍数做平行样)，将各个培养皿中的稀释液分别涂布于LB平板上， 于35～37℃培养箱中培养24h,计数每个平板上的可疑菌落数,挑取可疑菌落进行生化和血 清学鉴定验证后，得到1个已知浓度的沙门氏菌溶液。以同样的步骤对第二个浓度进行培 养分析，以此类推得到多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液；

4)已知浓度样品的制备，称适量步骤2)制备的空白上层总液，均分为八份，并分别 加入同等体积的步骤3)制备的已知浓度的沙门氏菌溶液，获得八份已知浓度样品；

5)确定沙门氏菌与掺硼金刚石膜电极响应电流的依从关系，采用CHI660D电化学工 作站用电化学计时电流的方法快速检测沙门氏菌的浓度，以掺硼金刚石膜电极为工作电极， 铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，设置工作电极的检测电位为0.9～1.15V， 电解池中为pH7.2～7.6的磷酸-磷酸盐缓冲溶液；将上述步骤4)获得的八份已知浓度样品 逐一进样，记录每次进样时掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值，根据全部进样的沙门 氏菌液浓度和与其对应响应电流的电流值作曲线，得到响应电流-沙门氏菌浓度曲线，该 曲线为一直线，确定沙门氏菌与掺硼金刚石膜电极响应电流的依从关系为线性关系；

6)待测样品的检测，称取待测肉类样品，按照步骤1)，获取待测上层总液，将待测 上层总液进样，记录掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值，结合步骤5)获得的响应电 流-沙门氏菌浓度曲线，得出待测肉类样品中的沙门氏菌浓度。

主要参考资料

[1] 内科疾病神经症状与精神障碍

[2]CN201610318472.0 一种沙门氏菌的检测试纸及其制备方法

[3]CN201310583375.0 一种检测样品中沙门氏菌活菌体的方法

[4]CN201610194726.2 一种肉类中沙门氏菌含量的检测方法