LNCAP细胞的应用

背景^[1-3]

LNCAP细胞于1977年从一名50岁的明确诊断为转移性前列腺癌的白人男性患者的左锁骨上淋巴结细针穿刺的活体组织中分离建立的。5-α-双氢睾酮可影响该细胞的生长和酸性磷酸酶的产生。

该细胞不形成均一的单层而是成簇生长，所以传代的时候要反复吹打形成单个细胞；该细胞贴壁不牢，达不到汇合状态，而且会使培养基迅速变酸；传代后48h内一定要保持培养瓶静止。如果此时挪动培养瓶，会使大部分细胞从瓶底脱落。如果出现此种情况，需要重新孵育24~48h使细胞重新贴壁，细胞贴壁后可更换培养基。

LNCAP细胞

当培养瓶封包后，多数LNCaP clone FGC细胞从培养瓶底分离，悬浮在培养基中。收到后，在通常培养单层细胞的条件下培养24-48小时，以使细胞再贴壁。此后，可以换上新鲜培养液。如果需要，培养瓶内容物可以收集，300g离心15分钟，以10毫升培养液重悬并培养到一个单独的培养瓶中。

细胞传代流程：

（1）吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加2-3ml0.25%胰酶进行消化细胞（注意把握消化时间，通常控制在1-2min）

（2）注意培养基PH值变化情况，定期换液（每周2-3次），待细胞密度达到80%以后重复1项操作或者冻存

（3）取部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养

（4）镜下观察消化情况，在HS505.T人淋巴结成纤维样细胞生长特性边缘缩小，贴壁松动时（不建议消化到细胞漂浮）去掉胰酶，加6-8ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落，吹散。

应用^[4][5]

用于柴胡皂苷d诱导前列腺癌LNCap细胞凋亡及自噬的研究

通过体外细胞实验研究柴胡皂苷d对前列腺癌LNCap细胞凋亡及自噬的影响,以期为临床治疗提供参考依据。

方法:本实验通过MTS法检测SSd对人前列腺癌LNCap细胞活力的影响;通过Hoechst 33258荧光染色、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,用Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。

此外,通过免疫荧光染色观察细胞内自噬标志物LC3Ⅰ/Ⅱ的表达以及Western Blot法检测自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、p62的表达,探讨SSd对LNCap细胞自噬的影响,同时研究自噬抑制剂和自噬激活剂对该过程的影响。

结果:1.MTS法检测细胞活力:不同浓度的SSd（0、2.5、5、10、20μmol/L）分别处理LNCap细胞24 h、48 h、72 h后,结果显示SSd能抑制LNCap细胞增殖,与对照组相比,随着给药浓度的增加,细胞活力下降;同一给药浓度,随着给药时间的延长,细胞活力下降,说明SSd对LNCap细胞增殖的抑制作用表现为一定的时间依赖性和浓度依赖性。

2. Hoechst 33258荧光染色观察细胞形态变化:对照组细胞核形态规则,呈现出弥散均匀的蓝色荧光,随着给药浓度的增加,不规则核细胞数逐渐增加,细胞质内出现浓染致密的颗粒块状蓝色荧光,当给药浓度达到20μmol/L时,大部分细胞核裂解,已经失去正常细胞核形态。

3. Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率:随着给药浓度的增加,细胞早期凋亡率及总凋亡率增加,差异均具有统计学意义（P<0.01）。说明SSd可诱导LNCap细胞凋亡,并呈浓度依赖性。

4. Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达:随着给药浓度的增加,凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达逐渐减少,促凋亡蛋白Bax的表达逐渐增加,差异有统计学意义（P<0.05）。

5. 免疫荧光染色观察细胞内自噬标志物LC3的表达:随着给药浓度的增加,共聚焦显微镜下观察到LC3荧光表达逐渐增强,说明LC3聚集增多,自噬增强。

6. Western Blot法检测自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、p62的表达:随着给药浓度的增加,p62蛋白表达逐渐减少,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达逐渐增加,差异有统计学意义（P<0.05）。

7.Western Blot法检测自噬抑制剂和自噬激活剂对SSd诱导的LNCap细胞自噬过程的影响:分别使用自噬抑制剂（3-MA）和自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin）,Western Blot结果显示,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62的蛋白相对表达量均发生相应变化。

参考文献

[1]Treatment challenges and survival analysis of human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer in real world[J].Praveen Adusumilli,Meher Konatam,Sadashivudu Gundeti,Stalin Bala,Lakshmi Maddali.Indian Journal of Medical and Paediatric Oncology.2017(1)

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[3]Hey Factors at the Crossroad of Tumorigenesis and Clinical Therapeutic Modulation of Hey for Anticancer Treatment[J].Zihao Liu,Andrew J.Sanders,Gehao Liang,Erwei Song,Wen G.Jiang,Chang Gong.Molecular Cancer Therapeutics.2017(5)

[4]Association of socioeconomics,surgical therapy,and survival of early stage hepatocellular carcinoma[J].Niek A.Peters,Ammar A.Javed,Jin He,Christopher L.Wolfgang,Matthew J.Weiss.Journal of Surgical Research.2017

[5]刘丹.柴胡皂苷d诱导前列腺癌LNCap细胞凋亡及自噬的研究[D].中国医科大学,2018.