U87MG细胞的应用

背景^[1-3]

U87MG细胞是由Ponten J等建立，源于恶性神经胶质瘤，裸鼠皮下接种可成瘤。U87MG细胞是上皮细胞样贴壁生长星形胶质母细胞瘤细胞，培养条件：DMEM+10%FBS。

细胞复苏步骤：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

U87MG细胞

细胞传代步骤：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

细胞冻存步骤：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

用于黑根霉胞外多糖促进U87MG细胞自噬及其分子机制研究

研究了EPS1-1对U87MG细胞自噬的影响及其作用机制,并对EPS1-1影响自噬和其与凋亡间的关系进行了初步探讨。通过MTT法和细胞克隆形成实验研究发现EPS1-1可以有效抑制U87MG细胞生长和增殖。电镜观察发现0.4mg/ml的EPS1-1处理48h后,U87MG细胞内产生了自噬溶酶体。

自噬小体膜结合形式的LC3（LC3-Ⅱ）常用于自噬的监测。EPS1-1能够显著增加U87MG-LC3-EGFP细胞内自噬小体数量。自噬相关基因ULK1、Beclin1、ATG5、ATG7、ATG12和LC3分别参与早期自噬囊泡膜的形成、Atg5-Atg12复合体形成以及介导囊泡膜延伸与闭合过程。

RT-qPCR分析显示,与空白对照组相比,0.4mg/ml的EPS1-1处理48h后,U87MG细胞内ULK1、Beclin1、ATG5、ATG7、ATG12和LC3基因的表达水平分别上调到1.53、1.81、1.68、2.05、1.94、和2.07倍,均达到显著性差异;0.8mg/ml的EPS1-1处理后,差异达到极显著性水平。

相关蛋白表达分析结果显示,U87MG细胞内LC3B-Ⅱ蛋白的表达量随着EPS1-1处理时间和浓度的增加而显著增加;此外,EPS1-1还能显著上调Beclin1、ATG5和ATG7蛋白的表达。表明EPS1-1能够诱导U87MG细胞自噬激活。

进一步研究发现,使用3-MA抑制细胞自噬活性,或者使用ATG7siRNA转染的方法干扰ATG7基因的表达后,均能显著下调细胞中LC3B-Ⅱ和ATG7的表达。巴弗洛霉素A1能够通过增加溶酶体的pH使自噬小体与其融合被阻断。

研究发现饱和浓度的巴弗洛霉素A1（100 nM）联合EPS 1-1（0.4 mg/ml）处理与单独使用巴弗洛霉素A1（100 nM）处理相比,细胞内LC3B-Ⅱ蛋白上调到1.24倍,差异达到极显著性。

表明,EPS1-1处理能够诱导U87MG细胞自噬流活化。营养饥饿等条件导致细胞内能量调节因子AMPK活化,活化的AMPK可抑制自噬负调控因子mTOR的活性进而诱导自噬。PTEN可以抑制PI3K/AKT/mTOR途径的激活。

Western blot分析发现,EPS1-1能增加U87MG细胞内PTEN和AMPK的磷酸化蛋白表达,降低AKT和mTOR的磷酸化蛋白表达。Rapamycin能够抑制mTOR的活性,与单独使用Rapamycin相比,Rapamycin联合EPS1-1处理后LC3B-Ⅱ蛋白表达量增加,两组间具显著性差异。

说明EPS1-1能够通过抑制mTOR途径的活性诱导U87MG细胞自噬。通过检测EPS1-1处理后U87MG细胞内相关凋亡指标发现,EPS1-1处理能够下调抗凋亡Bcl-2蛋白的表达,上调凋亡的标志分子Bax蛋白的表达。

与EPS1-1处理组相比,3-MA抑制自噬活性后显著下调了Bax的表达,而Rapamycin处理激活细胞自噬可以显著上调Bax蛋白的表达。这表明EPS1-1能够诱导U87MG细胞自噬促进细胞发生凋亡。

综上所述,黑根霉胞外多糖EPS1-1可以通过抑制mTOR途径的活性诱导U87MG细胞发生自噬进而促进其凋亡,这可能是其抗肿瘤活性的重要机制之一。

参考文献

[1]Apios americana Medik flowers polysaccharide（AFP-2）attenuates H 2 O 2 induced neurotoxicity in PC12 cells[J].Qiang Chu,Meng Chen,Dongxiao Song,Xixi Li,Yunyun Yang,Zihuan Zheng,Yonglu Li,Yangyang Liu,Lushuang Yu,Zheng Hua,Xiaodong Zheng.International Journal of Biological Macromolecule.2018

[2]Effect of polysaccharide from Undaria pinnatifida on proliferation,migration and apoptosis of breast cancer cell MCF7[J].Jun Wu,Hailun Li,Xinyue Wang,Xiaolei Zhang,Weiping Liu,Yumei Wang,Yongbin Zhang,Huafeng Pan,Qi Wang,Yun Han.International Journal of Biological Macromolecule.2018

[3]Functional polysaccharide Lentinan suppresses human breast cancer growth via inducing autophagy and caspase-7-mediated apoptosis[J].Weiyong Li,Jinglin Wang,Huiping Hu,Qiang Li,Ying Liu,Kaiping Wang.Journal of Functional Foods.2018

[4]Tremella polysaccharides inhibit cellular apoptosis and autophagy inducedby Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide in A549 cells through sirtuin 1 activation[J].Xiaolan Shi,Wenfeng Wei,Ning Wang.Oncology Letters.2018(6)

[5]刘静.黑根霉胞外多糖促进U87MG细胞自噬及其分子机制研究[D].山东大学,2019.