肺炎克雷伯氏菌的耐药性

背景^[1][2]

克雷伯氏菌属(Klebsiella)是肠杆菌科的一个属，由革兰氏阴性、不运动、兼性厌氧、氧化酶阴性和具有荚膜、单个、成对或呈短链排列的直杆菌组成。其菌体大小为(0.3～ 1.0)μm×(0.6～6.0)μm。大多数菌株能利用柠檬酸盐和葡萄糖，从葡萄糖产酸产气，VP实验阳性，发酵肌醇，水解尿素。本属中肺炎克雷伯氏菌是革兰氏阴性菌群体中引起肺炎最常见的病原菌。另外，也引起人的疾病，包括无症状的肠道、尿道或呼吸道中定植导致致死性菌血症，因而是医院病人重要的条件性致病菌。

该菌也能引起动物的肺炎、胃肠道炎、尿道炎和乳房炎等。在家畜垫草和饮水中均能发现该菌的存在。肺炎克雷伯氏菌是人类呼吸道和肠道的常居菌，可引起下呼吸道、血液、泌尿道、消化道、手术切口、颅内、皮肤软组织等多个部位感染，是医院感染及免疫缺陷者感染的重要病原菌。

近年来由于各种抗菌药物的广泛使用，导致肺炎克雷伯氏菌对多种抗菌药物产生耐药性，其耐药性可能与产生抗生素水解酶、生物被膜形成、外膜孔蛋白缺失、gyrA和parC基因变异、抗菌药物主动外排等机制有关。

毒理研究^[2]

肺炎克雷伯菌是社区获得性及医院获得性感染的常见病原体，可引起肺炎、脓毒症等多种感染，近年来逐渐成为肝脓肿的主要病原菌。hvKP引起的肝脓肿，常合并肝外转移病灶，如眼内炎、脑膜炎等，其中并发脑膜炎患者的致死率较高。多种毒力因子在肺炎克雷伯菌引起肝脓肿的过程中发挥了重要作用，例如荚膜多糖、脂多糖、铁摄取系统和菌毛等，但目前仍对某些毒力因子在致病过程中所起的作用不明确。

因此，对肺炎克雷伯菌的毒力因子进行深入研究有利于了解并阻断其致病过程，从而减少肝脓肿的发生，提高人群健康水平，减少社会医疗支出。随着对肺炎克雷伯菌毒力因子作用的进一步明确，有望实现早期检出hvkP，帮助临床医生早发现、早诊断肝脓肿，并及早给予治疗。

耐药机制^[3]

1. 肺炎克雷伯菌产β-内酰胺酶的耐药机制

1)β-内酰胺酶：β-内酰胺酶中以超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的产生在肺炎克雷伯菌耐药机制中最重要。肺炎克雷伯菌能产生质粒介导的超广谱β-内酰胺酶，可以对包括第三代头孢菌素在内的多种抗生素产生耐药，也是临床上最容易产生ESBLs的菌种1983年，最先在德国发现1株临床分离的肺炎克雷伯菌可以产生1种质粒介导的p一内酰胺酶，氨基酸序列分析显示是由于SHV-1在238位点发生甘氨酸到丝氨酸的突变所致，这种酶称为SHV-2。

随后，在临床分离出的肺炎克雷伯菌中发现了SHV-5、SHv-l2、SHV-13、SHV-14、SHV-16、SHV-1 8、SHv25—27等SHV型ESBLs和TEM一4TEM一48、TEM.49等TEM型的ESBLs，目前已发现TEM型ESBLs约100种。而且TEM~LSHV型检出率高，检出最少的基因型是OXA。过去认为肺炎克雷伯菌主要以产SHV、TEM型的ESBLs为主，但是近年来世界各地产CTX基因型的报道不断增。CTX-M基因型的特点对舒巴坦和克拉维酸耐药。

产ESBLs的CTX-M型主要对头孢塞肟和头孢曲松等具有较强的水解活性，产CTX-M15型ESBLs菌株对头孢他啶和头孢吡肟的耐药性高于产CTX-M14型ESBLs菌株，后来研究发现CTX-M 15型具有水解头孢他啶的活性。201 5年在欧洲文献报道CTX -M15型检出率高于CTX-M 14型。根据20 15年全国细菌耐药监测网的数据显示，革兰阴性杆菌中肺炎克雷伯菌排名第二，占临床分离革兰阴性杆菌菌株的19.8％。产ESBLs的肺炎克雷伯菌分离菌株比例由2007年的16.35％ ，近年上升为56.09％，细菌的耐药性日趋严重。

2）头孢菌素酶(AmpC)：AmpC酶是革兰阴性杆菌产生的又一类重要的β-内酰胺酶，属功能分类法的I组，分子分类法的C类，编码AmpC酶的基因常发现在肠杆菌科，包括肠杆菌属、志贺菌属、普罗威登斯菌属和大肠埃希菌属的染色体上。

1988年美国Rhode岛内感染流行，从那些院内患者中分离出1株肺炎克雷伯菌，此菌株产生的B一内酰酶是有BushI类酶的生化特性，其基因与阴沟杆菌的染色体AmpC基因有90％同源性，对第二代头孢菌素、头酶素及酶抑制剂复合物均耐药，且这种耐药性可传递，后来被确认为质粒介导~AmpC酶。质粒介导的AmpC酶是继ESBLs之后出现的革兰阴性杆菌耐AmpC酶细菌对至三代头孢菌素、头霉素、氨曲南等耐药，且不受临床常用的β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦抑制的重要原因。

迄今AmpC酶已有40余种基因型，世界范围内以CMY-2型多见，国内主要为DHA.1型~BACT-1型。近年来研究发现，AmpC酶不仅由染色体介导，也可由质粒介导，且质粒介导者因其具有较快的传播速度和较强的耐药性，质粒介导AmpC酶是肺炎克雷伯菌产生头孢菌素类以及碳青霉烯类多药耐药的重要原因。产酶株可以对多种抗生素产生耐药，耐药菌株的质粒携带耐药基因能够在菌株间迅速传播扩散。

3）碳青霉烯酶：碳青霉烯类抗生素是具有广谱抗菌活性的β-内酰胺酶内酰胺酶类抗生素，具有抗头孢菌素诱导酶、抗TEM和SHV型超广谱酶等优点，是治疗效果比较理想的抗感染药。由于临床广泛滥用，目前己出现了能水解碳青霉烯类的β-内酰胺酶内酰胺酶。肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性下降的最主要原因是产碳青霉烯酶。

它的催化基团活性部位均含丝氨酸残基，可以被克拉维酸和他唑巴坦抑制。Ambler分类法根据氨基酸序列的相似性将β-内酰胺酶内酰胺酶分为A、B、C、D4类，其中A、B、D类中具有水解碳青霉烯类活性的酶被称为碳青霉烯酶。A类KPC酶世界各地都有报道，B类和D类主要存在于医院发现的多重耐药菌株，C类很少有报道。

A类碳青霉烯酶主要有染色体编码的SME、IMI和NMC以及质粒编码的KPC和GES型。在肺炎克雷伯菌中发现的A类酶包括KPC型GES型及SHV-38型等。产KPC型碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药最常见的机制，目前己知的KPC1—22(KPC.1和KPC.2被证实是同一种酶 ，在肺炎克雷伯菌以KPC.2和KPC一3较为常见，其中又以KPC一2基因型最容易引起院内感染暴发流行。B类碳青霉烯酶又称金属D一内酰胺酶(MBL)，所有的金属酶都含有至少1个锌离子活性中心，其水解活性不被克拉维酸、舒巴坦等酶抑制剂抑制，但可以被乙二胺四乙酸(EDTA)及巯基化合物等金属离子螯合剂所抑制。

目前在肺炎克雷伯菌中检测到的金属酶主要有IMP、VIM和NDM等类型。迄今为止已发现的IMP酶共有38个类型，大多由IMP-1、IMP.2突变而来，同源性较高，主要通过I类整合子进行水平传播。VIM是所有类型金属酶中对碳青霉烯类的水解能力最强的1种金属酶。NDM-1是一种新的超级耐药基因，编码1种新的耐药酶，称为NDM-1金属β-内酰胺酶内酰胺酶。

2009年在印度新德里发现了1种超级细菌NDM-1，即新德里金属β-内酰胺酶内酰胺酶1，从南亚传入英国，很可能向全世界蔓延。NDM-1是ndm基因编码的产物，能水解几乎所有的B一内酰胺类抗菌药物，病菌变得无比强大，几乎所有抗生素都失效。目前已经发现存在于大肠埃希菌属的NDM包括NDM-1、NDM-3、NDM-4、NDM-5、NDM-6、NDM-7、NDM-8。

2014年中国苏州报道从肺炎克雷伯菌发现NDM-5基因。D类碳青霉烯酶又称苯唑西林酶(OXA酶)，大多对碳青霉烯类水解效率较低，不能水解氨曲南，常与其他耐药机制协同导致细菌对碳青霉烯类高度耐药。目前发现的OXA酶有200多种，在肺炎克雷伯菌中检出最多的为OxA.48。

肺炎克雷伯菌碳青霉烯类抗生素耐药的最主要机制是产碳青霉烯酶，而编码碳青霉烯酶的基因大多通过可移动质粒介导，易引起菌株间耐药基因的水平传播，由于耐碳青霉烯类的KPC、VIM、NDM的出现导致泛耐菌株的出现，仅有多黏菌素、磷霉素、替加环素等几种抗生素治疗有效。超级细菌NDM基因的出现，可能导致医院感染的暴发流行，这应当引起医务工作者的高度重视。

2. 肺炎克雷伯菌外膜蛋白的缺失和靶位的改变产生的耐药机制

1）外膜蛋白的缺失：克雷伯菌等革兰阴性菌细胞外膜脂多层中存在由许多微孔蛋白组成的孔道，它是一种非特导性的、跨越细胞膜的水溶性扩散通道，一些β-内酰酶类抗生素可经通道进入菌体内而发挥作用。一旦外膜孔蛋白缺失或减少就会影响抗生素进入细胞内的量大减，导致耐药。由于氨基糖甙等尚有其他通道进入细胞内，所以外膜孔蛋白缺失造成的耐药性主要与B一β-内酰胺酶内酰胺类抗生素有关。

2）靶位的改变：肺炎克雷伯菌对喹诺酮类耐药主要是靶位的改变。喹诺酮类抗生素的作用靶位有DNA旋转酶及拓扑异构酶A，两者均参与DNA的复制使得细菌无法复制而起抑菌作用。肺炎克雷伯菌主要的耐药机制是药物诱导的靶位点基因突变一染色体gyrA、gyrB基因的突变，该基因突变引起的耐药被认为不具有水平传播性。随着此类抗生素的过度应用，耐药菌不断出现。在20世纪，细菌耐喹诺酮类药物为DNA旋转酶编码基因f gyrA、gyrB、parC、parE)突变所致。其gyrA编码基因第83、87位密码子的突变是最常见的耐药原因。

3. 肺炎克雷伯菌生物膜的耐药机制

生物膜(bacterial biofilm)是细菌在群体生长过程中出现的一种特定现象，是细菌由其分泌的含水聚合性基质(主要是胞外多糖)黏附在物体或生物组织表面形成的结构性细菌群落。研究发现，自然界中99％的细菌是以生物膜的形式存在，65％的人类细菌感染与生物膜形成有关 。细菌一旦形成生物膜后，相对于游离菌难以被杀灭和清除。随着高科技的介入治疗，许多医用材料(如各种导管、人工关节、人工心脏瓣膜等)一旦被细菌黏附并形成生物膜，细菌污染不易消除，常导致感染迁延不愈。

4. 肺炎克雷伯菌外排泵的耐药机制

细菌的外排泵系统可分5大类：ATP结合盒转运体家族(ATP.binding cassete family，ABC)、主要易化因子超家族、药物与代谢物转运体超家族、DMT与之相关的小多药外排家族、多药物与毒物外排家族、耐受.生节一分裂家族RND类。尽管细菌耐药主动外排转运体种类众多，但是，目前研究显示，RND类的主动外排泵系统与细菌多重耐药性形成密切相关。

5. 肺炎克雷伯菌整合子的耐药机制

有研究表明，整合子阳性的肺炎克雷伯菌株耐药性比例高于整合子阴性的肺炎克雷伯菌。I类整合子阳性菌株对氨基糖苷 、喹诺酮类及大多数B.内酰胺类的耐药率高于I类整合子阴性的菌株。肺炎克雷伯菌临床分离株存在较广，含有I类整合子的肺炎克雷伯菌更易获得耐药性。

主要参考资料

[1] 现代乳品工业手册

[2] 引起肝脓肿的肺炎克雷伯菌毒力因子研究进展

[3] 李瑞蓉, 崔雪萍. 肺炎克雷伯菌主要耐药机制研究进展[J]. 中华临床实验室管理电子杂志, 2016, 4(2): 86-90.