BL21(DE3)PLYSS感受态细胞的应用

背景^[1-3]

BL21(DE3)PLYSS感受态细胞是采用大肠杆菌BL21（DE3）pLysS菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。使用pUC19质粒检测，转化效率可达10⁷，-70℃保存6个月转化效率不发生改变。

基因型：F-,ompT,hsdSB(rB-mB-),dcm,gal(DE3),pLysS,Cmr

质粒转化条件：42℃热激；诱导方法：IPTG；培养基:LB培养基；生长条件:

37℃,有氧；抗性:卡那霉素(15 ug/ml),氯霉素（34 ug/ml)。

BL21(DE3)PLYSS感受态细胞

菌株特点:

BL21 trxB(DE3)pLysS感受态细胞菌株是常用的目的蛋白表达菌株，该菌株有利于目的蛋白二硫键在细胞质中的形成，能有效提高含二硫键蛋白的正确折叠和表达。

BL21trxB宿主菌拥有与AD494菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变体（thioredoxin reductase mutation，TrxB）突变体。该菌株来源于BL21菌株。由于含有trxB蛋白的宿主菌能够有效提高细胞质内二硫键形成，他们能够提高目的蛋白的正确折叠率。该宿主菌具有卡那霉素抗性，所以这个菌株只能用于氨苄霉素抗性的质粒表达。

DE3是溶源性的λDE3,所以在lacUV5启动子下携带有T7 RNA聚合酶的染色体拷贝。该菌株适用于pET系列载体，及其他T7启动子系列载体。

含有pLSs质粒，pLySs质粒能够产生T7溶菌酶，可以有效降低目的基因的基础表达水平。pLySs质粒使得该菌株具有氯霉素抗性。pLySs质粒的起始复制位点是p15 Origin,这使得该质粒能够和pUC-及pBR322-衍生的质粒互相共存。

应用^[4][5]

用于大肠杆菌BL21（DE3）感受态制备及转化影响因素的研究

用大肠杆菌细胞制备感受态,然后进行转化实验,已经成为分子生物学实验中频繁应用的一项基础实验手段。制备高效而稳定的大肠杆菌感受态细胞是后续基因克隆、基因表达工作的重要保障,大肠杆菌感受态细胞转化效率的高低,对于后续实验的成败也起到非常重要的作用。

大肠杆菌BL21（DE3）常用作外源基因表达的宿主菌,研究其感受态的制备和转化效率有一定的实际应用价值。大肠杆菌的制备和转化是一个复杂的生物物理和化学反应的过程。不同基因型的菌种、菌体的生长状态、感受态细胞的制备方法和制备条件、转化过程的实验参数、保存技术、质粒的大小等实验因素对转化结果都能产生影响。

对大肠杆菌BL21（DE3）感受态制备和转化的影响因素进行了系统性的研究,并优化了TSS法,掌握了大肠杆菌BL21（DE3）制备及转化实验中需要把控的关键实验参数。

通过本次研究可以得出:（1）保存两年的大肠杆菌BL21（DE3）甘油菌,在LB液体培养基中进行过夜培养,转接活化两次,30℃下,培养2-3小时后的生长状态,是制备感受态的时期;

（2）大肠杆菌BL21（DE3）的转化时期出现在OD600=0.4-0.5时,也就是在对数生长期的中前期。此时,大肠杆菌BL21（DE3）的活菌数目可以达到1×108个/m L;当OD600=0.46时,用CaCl2方法转化p UC19质粒,转化效率可以达到4.6×106 cfu/μg质粒DNA;

（3）用TSS缓冲液对OD600=0.46的大肠杆菌BL21（DE3）进行处理,并制备感受态细胞,在转化体系中加入5×KCM（KCl、CaCl2、Mg Cl2的混合溶液）,在复苏过程中加入含有0.2 mol/L葡萄糖的LB培养基,在一定的转化条件下将质粒p UC19转入,其转化效率能够达到1.48×107 cfu/μg质粒DNA;

（4）用优化的TSS法制备感受态并进行质粒转化的实验条件:取培养至OD600=0.46的大肠杆菌BL21（DE3）菌液,在无菌预冷离心管中冰浴30min,4℃,4200r/min离心10 min,收集菌体,加入原菌液量1/10的TSS缓冲液,悬浮细胞并分装至100 ul,保存至-70℃;转化时在感受态细胞中加入质粒5μL,5×KCM 20μL,去离子水75 ul,轻轻混匀,冰浴30 min,室温放置10 min,加入400μL含0.2 mol/L葡萄糖的LB培养基,摇床37℃,180 r/min,复苏40 min;取200μL转化产物涂板并过夜培养12-16小时;

（5）用优化过的TSS法制备感受态,转化pUC19质粒,得到的转化效率是CaCl2方法的3.2倍。

参考文献

[1]Novel one step transformation method for Escherichia coli and Staphylococcus aureus using arginine-glucose functionalized hydroxyapatite nanoparticles[J].Ketaki Deshmukh,Sutapa Roy Ramanan,Meenal Kowshik.Materials Science&Engineering C.2019

[2]Systematic comparison of co-expression of multiple recombinant thermophilic enzymes in Escherichia coli BL21（DE3）.[J].Chen Hui,Huang Rui,Zhang Y-H Percival.Applied microbiology and biotechnology.2017(11)

[3]CTAB-mediated,single-step preparation of competent Escherichia coli,Bifidobacterium sp.and Kluyveromyces lactis cells[J].Kammara Rajagopal,Praveen Kumar Singh,Rajesh Kumar,Kaneez Fatima Siddiqui.Meta Gene.2014

[4]New method for electroporation of Lactobacillus species grown in high salt[J].Maria Mercedes Palomino,Mariana C.Allievi,Mariano Prado-Acosta,Carmen Sanchez-Rivas,Sandra M.Ruzal.Journal of Microbiological Methods.2010(2)

[5]滕丽雯.大肠杆菌BL21（DE3）感受态制备及转化影响因素的研究[D].齐鲁工业大学,2021.