MC3T3-E1 SUBCLONE 14细胞的应用

背景^[1-3]

MC3T3-E1 SUBCLONE 14细胞是从克隆的但是表型各异的MC3T3-E1细胞系中分离出一系列亚克隆。从含抗坏血酸培养基生长的成骨细胞中选择高或低成骨细胞分化、矿化的亚克隆。MC3T3亚克隆4（ATCC CRL-2593）和MC3T3亚克隆14（ATCC CRL-2594）在抗坏血酸和3到4mM无机磷酸盐中生长表现出高水平的成骨细胞分化。它们10天后形成一个矿化良好的细胞外基质（ECM）。

MC3T3亚克隆24（ATCC CRL-2595）和MC3T3亚克隆30（ATCC CRL-2596）在抗坏血酸中生长表现出很差的成骨细胞分化。不形成ECM，可以作为亚克隆4和14的阴性对照。矿化的亚克隆选择的表达作为成骨细胞标记的mRNA，及唾液酸糖蛋白（BSP），骨钙素（OCN），和甲状旁腺激素/甲状旁腺激素相关蛋白受体的mRNA。

MC3T3-E1 SUBCLONE 14细胞

高或者低的分化潜能的亚克隆在培养中生产出相似数量的胶原质，表达可比较的基本水平的mRNA编码Osf2/Cbfa1，一种成骨细胞相关转录因子。植入免疫缺陷小鼠以后，高分化性的亚克隆形成与骨类似的形成小骨的编织骨，低分化细胞只是产生纤维组织。这些细胞系是研究体外成骨细胞分化的好模型，尤其是ECM信号。它们和原代培养颅顶成骨细胞的行为类似。培养条件培养基：90%MEMα(添加NaHCO3 1.5g/L，肌醇43.2mg/L,叶酸8.82mg/L,β-巯基乙醇7.8mg/L)+10%胎牛血清+1%双抗；温度：37℃；气相：95%空气，5%二氧化碳。

应用^[4][5]

用于辐射与RNA干扰对MC3T3-E1 Subclone 14成骨样细胞相关因子骨钙素（OCN）影响的初步研究

对MC3T3-E1 Subclone 14细胞辐射与RNA干扰方法敲减ppGalNAc-T1处理后对OCN表达的影响进行研究,以判定多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶1（ppGalNAc-T1）与OCN表达变化相关性,从而对ppGalNAc-T1基因在成骨细胞活性及分化机制中的作用及辐射的影响有一初步了解。

方法:1.对MC3T3-E1 Subclone 14细胞进行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy剂量辐射24h后进行MTT测吸光值,观察细胞在5天内的增殖情况差异。

2. 对MC3T3-E1 Subclone 14细胞进行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy剂量辐射24h后,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡差异。

3. 对MC3T3-E1 Subclone 14细胞进行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy剂量辐射24h后换液培养至14d,RT-PCR检测4d、7d、10d、14d时ppGalNAc-T1和OCN的表达差异。

4. 设计四条可能的ppGalNAc-T1小干扰RNA（siRNA）,分别将这四段siRNA插入到RNA干扰载体pGPU6/GFP/Neo中构建成四条干扰载体pGPU6/GFP/Neo-si ppGalNAc-T1-1,2,3,4。

5. 通过脂质体介导将四条干扰表达载体按转染体系转染MC3T3-E1 Subclone 14细胞,48小时后,RT-PCR方法检测ppGalNAc-T1基因在转录水平的差异,筛选出对ppGalNAc-T1有抑制效果的干扰表达载体。

6. 将筛选出的干扰表达载体转染MC3T3-E1 Subclone 14细胞,48小时后,通过RT-PCR方法检测ppGalNAc-T1在mRNA的改变,并通过RT-PCR、Western-Blot方法分别检测OCN mRNA和蛋白表达量的差异。

结果:1.0.5Gy、2.0Gy剂量辐射与空白对照组相比,不能明显影响MC3T3-E1 Subclone 14细胞增殖能力（P>0.05）,而1.0Gy剂量辐射显著能增强细胞增殖能力（P﹤0.05）。

2. 0.5Gy、2.0Gy剂量辐射与空白对照组相比,对MC3T3-E1 Subclone 14凋亡没有明显影响（P>0.05）,而1.0Gy剂量辐射对MC3T3细胞凋亡有显著的抑制作用（P﹤0.05）。

3.0.5Gy,1.0Gy及2.0Gy剂量辐射与空白对照组相比,均能上调OCN和ppGalNAc-T1 mRNA的表达趋势,其中1.0Gy组的表达显著高于空白对照组（P﹤0.05）。

结论:1.辐射剂量1.0Gy可显著促进MC3T3-E1 Subclone 14细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调OCN和ppGalNAc-T1 mRNA的表达。

3. 利用SiRNA干扰技术,构建ppGalNAc-T1干扰表达载体,并成功筛选出一条有效的ppGalNAc-T1基因的siRNA载体。

通过检测转染后mRNA和蛋白水平表达量检测,结果显示:当有效阻断ppGalNAc-T1基因表达,OCN基因的表达也显著性受到抑制。为研究ppGalNAc-T1在成骨细胞分化与增殖过程中的作用提供了实验基础和理论支持,并为研究RNAi在临床上的应用提供了技术支持。

参考文献

[1]Dicers at RISC[J].Marcel Tijsterman,Ronald H.A Plasterk.Cell.2004(1)

[2]ATP Requirements and Small Interfering RNA Structure in the RNA Interference Pathway[J].Cell.2001(3)

[3]Evidence that conditionally immortalized human osteoblasts express an osteocalcin receptor[J].P.V.N Bodine,B.S Komm.Bone.1999(5)

[4]Molecular basis and clinical application of biological markers of bone turnover.Calvo MS,Eyre DR,Gundberg CM.Endocrine Reviews.1996

[5]赵俊宇.辐射与RNA干扰对MC3T3-E1 Subclone 14成骨样细胞相关因子骨钙素（OCN）影响的初步研究[D].苏州大学,2011.