GBC-SD细胞的应用

背景^[1-3]

GBC-SD细胞是从一位61岁的男性低分化胆囊癌患者中建立的。细胞的形状有多边形、纺锤形和正方形。分泌CEA和CA19-9。倍增时间大约为21.4小时。可移植到裸鼠。生成的肿瘤与原发肿瘤相似。培养条件： RPMI-1640(添加NaHCO3 1.5g/L，glucose 2.5g/L，Sodium Pyruvate 0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。气相：空气，95%；二氧化碳，5%，温度：37摄氏度。

GBC-SD细胞

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于人胆囊癌SP细胞的分选、鉴定及TGF-β对其丰度的影响和机制的研究

胆囊癌细胞系GBC-SD中SP细胞的分离、鉴定目的在人胆囊癌细胞系GBC-SD中检测、分选SP细胞亚群,并检测该群细胞与干细胞相关的生物学特性。

方法：采用荧光激活细胞分选技术（FACS）从人胆囊癌细胞系GBC-SD中检测、分选人胆囊癌SP细胞、非SP细胞；利用Transwell侵袭小室模型检测SP、非SP细胞侵袭能力,通过MTT方法检测化疗药物对SP、非SP细胞生长抑制的影响；通过定量PCR检测SP、非SP细胞ABC家族中4种转运蛋白（ABCA2,MDR1,MRP1和ABCG2）的表达；通过流式技术分析SP、非SP细胞与4种干细胞标记物（CD24,CD34,CD44和CD133）的关系；

利用体内、外成瘤实验检测两种细胞亚群的成瘤特性,并通过FACS检测新鲜人胆囊癌组织中SP细胞的表达。结果人胆囊癌细胞系GBC-SD中存在少量的SP细胞,约占总体细胞比例的0.87%；SP细胞较非SP细胞具有高的侵袭能力、耐药特性,并高表达ABC转运蛋白（P<0.05）；

体内、外实验证明SP细胞具有强的致瘤能力,并可再生SP和非SP细胞,且再生的SP细胞的比例与分选前GBC-SD细胞中SP比例相似；7例人胆囊癌组织中也包含着不同比例的SP细胞亚群。结论人胆囊癌细胞系GBC-SD中SP细胞亚群具有类似干细胞的生物学特性。

在体外培养的GBC-SD细胞中加入TGF-、后,相差倒置显微镜下观察细胞形态学变化,通过RT-PCR、Western blotting检测E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白水平表达；并通过MTT检测发生EMT的GBC-SD细胞对3种化疗药物吉西他滨、米托葸醌和表柔比星的敏感性；通过FACS和定量PCR分别检测GBC-SD在TGF-β诱导下SP细胞比例的改变以及ABCG2 mRNA的表达。结果TGF-β可诱导GBC-SD细胞向间质型细胞形态转化,间质标记蛋白Vimentin mRNA和蛋白水平表达上调,上皮标记蛋白E-cadherin的mRNA和蛋白水平表达下调；且发生EMT后GBC-SD细胞对吉西他滨、米托蒽醌和表柔比星的IC50值分别增加倍8.1倍、40倍和5.7倍。GBC-SD细胞在TGF-β处理下,SP细胞的丰度以及ABCG2 mRNA表达均明显增加；撤除TGF-β诱导后,发生EMT转化的GBC-SD细胞逐渐恢复至上皮细胞表型。

参考文献

[1]Insights into minimal residual disease in cancer patients:Implications for anti-cancer therapies[J].Volkmar Müller,Catherine Alix-Panabières,Klaus Pantel.European Journal of Cancer.2010(7)

[2]Identification of neuroblastoma stem cells by characterization of side population cells in the human neuroblastoma SK-N-SH cell line[J].Shiqin Qi,Jicui Zheng,Haitao Zhu,Lin Yang,Xianmin Xiao.Journal of Pediatric Surgery.2010(12)

[3]Characterization of side population cells in human malignant mesothelioma cell lines[J].Kiyonori Kai,Susan D’Costa,Byung-Il Yoon,Arnold R.Brody,Robert C.Sills,Yongbaek Kim.Lung Cancer.2010(2)

[4]Matrix Metalloproteinase-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer[J].Evette S.Radisky,Derek C.Radisky.Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia.2010(2)

[5]张志发.人胆囊癌SP细胞的分选、鉴定及TGF-β对其丰度的影响和机制的研究[D].华中科技大学,2011.