谷氨酸脱羧酶65+谷氨酸脱羧酶67抗体的应用

背景^[1-3]

谷氨酸脱羧酶65+谷氨酸脱羧酶67抗体是一类可以特异性结合谷氨酸脱羧酶65和谷氨酸脱羧酶67的多克隆抗体，主要用于对谷氨酸脱羧酶65和谷氨酸脱羧酶67的免疫学实验。

谷氨酸脱羧酶主要含于脑的灰质中，富含突触体的部分。脑内的GABA是由谷氨酸脱羧而成的。GABA的合成酶为谷氨酸脱羧酶。该酶主要含于脑的灰质中，富含突触体的部分。GAD大部分以游离的形式存在于轴突末梢的胞质内，参与GABA的合成，少量以结合的形式存在于线粒体中。

谷氨酸脱羧酶65+谷氨酸脱羧酶67免疫组化

谷氨酸脱羧酶(GAD)，是将谷氨酸转化成抑制性神经递质γ氨基丁酸（GABA）的限速酶，在胰岛β细胞中存在GAD，并也合成、分泌GABA。谷氨酸脱羧酶抗体(ADAG)是1型糖尿病发病初期的免疫标志，也作为1型糖尿病患者接受治疗时的疗效监测指标。

－氨基丁酸（GABA）作为重要的抑制性神经递质，在正常的生命活动中发挥着重要的功能，其异常表达与多种疾病密切相关。谷氨酸脱羧酶是GABA的限速酶，包括GAD1（也称为GAD67）和GAD2（也称为GAD65）两种异构体，GAD67)，两者虽然催化同一反应，其分布特征及生理功能却不尽相同。最近的研究表明，GABA和GAD1，而非GAD2在多种肿瘤中存在着异常的上调表达，其上调表达的分子机制及其高表达后在肿瘤发生发展中的作用尚不清楚。

应用^[4][5]

用于谷氨酸脱羧酶在术后肠梗阻模型大鼠小肠上的表达变化研究

观察正常大鼠空肠、回肠、结肠中的GAD表达与分布;检测POI模型大鼠肠道肌层内GABA和GABA受体表达的变化;检测POI模型大鼠肌层肠道免疫细胞变化与种类,以及肌间神经节胆碱能系统的改变;探讨免疫细胞和GABA系统在POI肠动力障碍中的作用;观察大鼠肠道冰冻切片组织内AF的表达情况,并探讨SBB降低大鼠肠道AF的条件,从而获得优化的特异性IF信号以便更准确的反映大鼠肠道内抗原的实际表达。

方法1.动物模型制备:采用成年健康雄性SD大鼠,10%水合氯醛麻醉,将小肠牵出用湿棉球上下擦拭五到六次后还纳回腹腔。

2. 取材:术后24 h后取材,部分新鲜组织用于Western blot,部分用4%多聚甲醛固定,梯度蔗糖脱水后做冰冻切片用于形态学检测。

3. 利用肠推进运动实验评估肠动力,利用HE染色观察POI大鼠的肠道形态并进行肠道黏膜损伤Chiu’s病理评分。

4. 利用免疫组织化学和免疫荧光技术检测正常大鼠空肠、回肠和结肠内GAD、GABA受体的表达和分布。

5. 利用免疫组织化学和免疫荧光技术检测POI组与假手术组（Sham）大鼠空肠、回肠和结肠内GAD、GABA B受体（GABAB）、乙酰胆碱转移酶（Choline acetyltransferase,ChAT）的表达与改变。

6. 利用Western blot技术检测POI与Sham组大鼠肠道内GABAB受体表达的变化。

7. 观察正常SD大鼠肠道内的AF,测试肠道SBB染色的适宜浓度和时间,并观察SBB染色应用于IF染色后对肠道AF的影响。

结果1.正常大鼠空肠和回肠黏膜和肌层中均表达有GAD。

2. POI大鼠模型造模成功。

3. POI大鼠小肠肌层的GAD表达增加,且GAD阳性细胞多同时表达CD45及CD68。4.POI大鼠小肠肌层GABAB受体表达上调,肌间神经节内ChAT表达降低。

5.大鼠肠道内存在大量AF,且不受血清封闭影响;0.3%SBB染色10 min可显著降低大鼠肠道AF,提高IF染色特异性。

结论正常大鼠肠道黏膜与肌层均分布有GAD阳性细胞。POI时大量免疫细胞在肌层浸润,这些细胞可能通过合成GABA并激活肌间神经节内胆碱能神经元上表达的GABAB受体,通过其抑制作用降低胆碱能神经元活性,最终降低维持平滑肌收缩的胆碱能信号,抑制肠动力。

参考文献

[1]Association between gastrointestinal motility and macrophage/mast celldistribution in mice during the healing stage after DSS?induced colitis[J].Mio Kodani,Hirokazu Fukui,Toshihiko Tomita,Tadayuki Oshima,Jiro Watari,Hiroto Miwa.Molecular Medicine Reports.2018(6)

[2]Autofluorescence:A potential pitfall in immunofluorescence-based inflammation grading[J].Jonas Wizenty,Muhammad Imtiaz Ashraf,Nadine Rohwer,Martin Stockmann,Sascha Weiss,Matthias Biebl,Johann Pratschke,Felix Aigner,Tilo Wuensch.Journal of Immunological Methods.2018

[3]Attenuated GABAergic Signaling in Intestinal Epithelium Contributes to Pathogenesis of Ulcerative Colitis[J].Surbhi Aggarwal,Vineet Ahuja,Jaishree Paul.Digestive Diseases and Sciences.2017(10)

[4]Role of macrophages in age-related oxidative stress and lipofuscin accumulation in mice[J].Carmen Vida,Irene Martínez de Toda,Julia Cruces,Antonio Garrido,Mónica Gonzalez-Sanchez,Mónica De la Fuente.Redox Biology.2017

[5]李勇.谷氨酸脱羧酶在术后肠梗阻模型大鼠小肠上的表达变化[D].新乡医学院,2020.