一氧化氮合成酶-2抗体(诱导型)的应用

背景^[1-3]

一氧化氮合成酶-2抗体(诱导型)是一类可以特异性结合一氧化氮合成酶-2的多克隆抗体，主要用于对一氧化氮合成酶-2的免疫学实验。

一氧化氮合酶一氧化氮合酶于神经系统，其同功酶有三种亚型，即在正常状态下表达的神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及在损伤后诱导表达的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。来源于诱导型一氧化氮合酶和神经元型一氧化氮合酶的一氧化氮合酶有神经毒性作用，来源于内皮型一氧化氮合酶的一氧化氮有神经保护作用。

一氧化氮合成酶-2

诱导型一氧化氮合酶是利用一氧化氮的氧化应激(自由基)，协助巨噬细胞在免疫系统中对抗病原体的一类酶。它亦存在于心血管系统内。与建构型一氧化氮合酶不同，它只是在细胞受到刺激而被激活后才发挥功效，并且所生成的一氧化氮数量亦较多。一氧化氮合酶存在于神经元中，在不同脑区呈选择性分布。

一氧化氮（Nitric oxide,NO）作为重要的信号分子和效应分子参与多种生理过程。机体通过一氧化氮合成酶（Nitric oxidesynthase,NOS）来合成NO，而诱导型NOS（inducible NOS,iNOS）因其具有的诱导表达及高效产生NO的特性使其成为机体免疫系统用来对抗入侵的微生物及清除自身肿瘤细胞的重要工具。

应用^[4][5]

用于热休克蛋白70抑制剂PFT-μ对诱导型一氧化氮合成酶诱导表达及蛋白稳定性的影响研究

热休克蛋白（Heatshock protein,HSP）是细胞内表达丰度最高的蛋白，在受到热休克等应激刺激时还会大量诱导表达。前期的研究证实HSP90对iNOS表达、活性及蛋白稳定性有重要影响，而作为与之紧密相关的HSP70是否有相似的作用目前尚不清楚。PFT-μ（Pifithrin-mu）是由George等于2009年首次在Mol Cell上报道的对HSP70具有高度选择性的一种小分子抑制剂，这为我们研究HSP70提供了一个有力的研究工具。

探讨PFT-μ作为特异性热休克蛋白70抑制剂对IFN-γ诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞NO产生及iNOS表达的影响及分子调控机制；观察PFT-μ对脓毒症小鼠主要组织内iNOS表达的影响，观察PFT-μ是否参与iNOS蛋白翻译后的稳定性。

方法:采用LPS/IFN-γ诱导RAW264.7巨噬细胞株构建炎症反应的细胞模型，Western-Blot检测iNOS等蛋白表达；定量聚合酶链反应（q-PCR）分析iNOS mRNA表达改变，Griess试剂测定培养基中NO的含量；HSP70siRNA转染RAW264.7巨噬细胞检测iNOS等蛋白表达；Western-Blot检测转录因子STAT1磷酸化水平及IRF-1诱导表达及胞核转移情况、染色质免疫共沉淀（Chromosome immunoprecipitate assay,ChIP）检测p-STAT1和IRF-1与iNOS基因启动子区的结合；Western-Blot检测胞浆可溶性及沉淀中iNOS蛋白；构建内毒素血症小鼠模型检测主要组织内iNOS表达水平的变化。

结果:在IFN-γ诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞中，PFT-μ在8-12小时可抑制NO生成（P<0.05）；PFT-μ在8-12小时可下调iNOS蛋白和mRNA表达（P<0.05）；HSP70siRNA转染后可下调iNOS蛋白水平；PFT-μ不影响细胞内STAT1、磷酸化STAT1的水平，PFT-μ不影响IRF-1蛋白的表达及细胞内胞浆与胞核间转移；PFT-μ在2小时可降低p-STAT1和IRF-1对iNOS启动子区的结合（P<0.05）；PFT-μ不影响iNOS mRNA的稳定性（P>0.05）；PFT-μ不影响iNOS的蛋白稳定性；PFT-μ可抑制内毒素血症小鼠主要组织内iNOS的蛋白及mRNA的表达（P<0.05）。

结论：PFT-μ可降低LPS/IFN-γ诱导的RAW264.7中NO的生成、iNOS蛋白和mRNA表达；PFT-μ通过抑制转录因子p-STAT1和IRF-1与iNOS基因启动子结合而减少iNOS生成；PFT-μ对iNOS mRNA及蛋白质稳定性无影响；PFT-μ可在小鼠体内抑制iNOS表达。

参考文献

[1]Inducible nitric oxide synthase aggresome formation is mediated by nitric oxide[J].Tingting Wang,Yong Xia.Biochemical and Biophysical Research Communications.2012(3)

[2]Nitric oxide signaling:Classical,less classical,and nonclassical mechanisms[J].Antonio Martínez-Ruiz,Susana Cadenas,Santiago Lamas.Free Radical Biology and Medicine.2011(1)

[3]Nitric oxide at a glance[J].Khalid M.Naseem,Wayne Roberts.Platelets.2011(2)

[4]EFFECTS OF A SELECTIVE iNOS INHIBITOR VERSUS NOREPINEPHRINE IN THE TREATMENT OF SEPTIC SHOCK[J].Fuhong Su,Hongchuan Huang,Kazuki Akieda,Giovanna Occhipinti,Katia Donadello,Michael Piagnerelli,Daniel De Backer,Jean-Louis Vincent.Shock.2010(3)

[5]张利军.热休克蛋白70抑制剂PFT-μ对诱导型一氧化氮合成酶诱导表达及蛋白稳定性的影响[D].重庆医科大学,2013.