人抗磷脂酰丝氨酸抗体(APSA)ELISA KIT

背景^[1-3]

人抗磷脂酰丝氨酸抗体(APSA)ELISA KIT采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法（Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay,ELISA）特异性检测样本中磷脂酰丝氨酸抗体(APSA)的含量。

实验原理：往预先包被人抗磷脂酰丝氨酸抗体(APSA)抗体的包被酶标板孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗磷脂酰丝氨酸抗体(APSA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人抗磷脂酰丝氨酸抗体(APSA)ELISA KIT

样本处理及要求：

a.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

b.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

c.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

用于抗磷脂抗体促进非小细胞肺癌浸润转移及机制的探讨研究

研究抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody,ACA）、抗β2糖蛋白Ⅰ抗体（anti-β2glycoproteinⅠ,anti-β2 GPⅠ）在非小细胞肺癌血清中的表达,计数非小细胞肺癌组织中微血管的密度,探讨血清中抗磷脂抗体与肺癌浸润转移及血管密度的相关性,并检测抗磷脂综合症（APS）来源的aPL+（IgG）对肺癌CSF-1、TF、VEGF基因表达的影响,进一步观察aPL+（IgG）对肺癌细胞增殖和侵袭的影响,为非小细胞肺癌浸润转移的机制提供新的思路。

方法:（1）化学发光法检测肺癌患者组和健康对照组血清中抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody,ACA-IgG、Ig M）、抗β2糖蛋白Ⅰ抗体（anti-β2glycoproteinⅠ,anti-β2 GPⅠ-IgG、Ig M）的表达,免疫组化方法检测肺癌组织中微血栓及血管密度。

（2）亲和层析柱法提取抗磷脂综合症患者血清中总IgG,SDS-PAGE方法检测所提取IgG的纯度。

（3）流式细胞术及免疫荧光法检测肺癌细胞A549、H1299、H460磷脂酰丝氨酸的暴露。

（4）RT-PCR的方法检测不同时间段对照组及aPL+（IgG）处理组A549细胞CSF-1、TF、VEGF的表达。

（5）CCK-8检测aPL+（IgG）对A549细胞增殖能力的影响,细胞克隆实验进一步验证aPL+（IgG）对细胞增殖能力的影响。

（6）Transwell实验检测aPL+（IgG）对A549细胞侵袭能力的影响。

参考文献

[1]Diagnosis of catastrophic anti-phospholipid syndrome in a patient tested negative for conventional tests.[J].Conti Fabrizio,Priori Roberta,Alessandri Cristiano,Misasi Roberta,Capozzi Antonella,Pendolino Monica,Truglia Simona,Frisenda Silvia,Sorice Maurizio,Valesini Guido.Clinical and experimental rheumatology.2017(4)

[2]Catastrophic antiphospholipid syndrome treated with rituximab:A case report.[J].Do?ru Atalay,Ugan Yunus,?ahin Mehmet,Karahan Nermin,Tun??evket Ercan.European journal of rheumatology.2017(2)

[3]Fatal antiphospholipid syndrome following endoscopic transnasal-transsphenoidal surgery for a pituitary tumor:A case report.[J].Li Chiao-Zhu,Li Chiao-Ching,Hsieh Chih-Chuan,Lin Meng-Chi,Hueng Dueng-Yuan,Liu Feng-Chen,Chen Yuan-Hao.Medicine.2017(1)

[4]Is Increase of Homocysteine,Anti-Cardiolipin,Anti-Phospholipid Antibodies associated with Breast Tumors?[J].Abdollahi Alireza,Omranipour Ramesh.Acta medica Iranica.2015(11)

[5]樊珂珂.抗磷脂抗体促进非小细胞肺癌浸润转移及机制的探讨[D].大连医科大学,2018.