小鼠前列腺癌细胞RM-1的应用

背景^[1-3]

小鼠前列腺癌细胞RM-1组织来源于前列腺癌的上皮细胞样细胞系，生长培养基：RPMI-1640＋10%FBS＋1%P/S；培养条件气相：空气，95%；CO2，5%，温度：37℃。

小鼠前列腺癌细胞RM-1

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于雷公藤内酯醇对小鼠前列腺癌作用及其机制的研究

探讨方中有效抗癌成分雷公藤内酯醇对小鼠前列腺癌细胞株RM-1和小鼠前列腺癌模型的增殖抑制作用及其可能机制，以期为临床提供安全有效的抗前列腺癌药物。

方法：体外实验采用小鼠前列腺癌RM-1传代细胞，用MTT实验检测TL对RM-1细胞的增殖抑制作用；用吖啶橙荧光染色检测TL对RM-1凋亡细胞形态学影响；用流式细胞术分析TL对RM-1细胞周期及凋亡峰的作用；用梯状电泳方法检测TL对RM-1细胞DNA的凋亡作用；用RT-PCR法检测TL对RM-1细胞caspase-3、bcl-2 mRNA表达水平的影响。

体内实验采用C57BL／6小鼠皮下注射RM-1细胞，建立前列腺癌动物模型，检测肿瘤体积和重量计算肿瘤生长抑制率；TUNEL技术检测前列腺癌组织中凋亡细胞；免疫组化检测方法观察药物对实验动物肿瘤组织caspase-3基因及其蛋白bcl-2表达水平的影响。

结果：1．TL（5、10、20、40、80 ng／ml）处理后RM-1细胞生长抑制率分别为9.8％、25.1％、39.2％、48.8％、53.2％，以TL（10、20 ng／ml）处理RM-1细胞12、24、36、48h后，细胞生长抑制率分别为8.4％、25.1％、36.1％、42.4％和10.2％、39.2％、50.2％、58.5％，MTT检测显示雷公藤内酯醇呈剂量和时间依赖性抑制RM-1细胞的生长。

2．前列腺癌小鼠模型建立14d后，TL（0.2mg／kg）、TL（0.4mg／kg）、TL（0.8／g／kg）组小鼠肿瘤生长较慢，瘤重与模型对照组比较差异显著（P＜0.01）。体内实验结果显示一定浓度TL能抑制小鼠体内前列腺癌细胞生长。

3．吖啶橙荧光染色观察显示，经TL处理RM-1细胞核浓缩，细胞膜内陷、胞内有不规则橘黄色颗粒，呈凋亡样形态学改变。

4．流式细胞术分析细胞周期及凋亡峰，结果显示TL（10、20ng／ml）作用RM-1细胞48h后，在G1期前出现明显的凋亡峰，凋亡率分别为41.1％和57.8％。5．DNA电泳分析表明，TL处理24h、36h、48h各组均可见DNA“梯形”图谱，48h作用细胞DNA“梯形”条带尤为明显。

TUNEL染色结果显示，前列腺癌动物模型经TL给药后，TUNEL染色阳性细胞增多，其核内有棕黄颗粒-凋亡小体，呈小圆形，核浓缩、大量微核体的形成。实验表明TL具有诱导前列腺癌细胞凋亡的作用。

参考文献

[1]Baltaci S,Orhan D,Gogus C,et al.Inducible nitric oxide synthase expression in benign prostatic hyperplasia,low-and high-grade prostatic intraepithelial neoplasia and prostatic carcinoma.[J].BJU International,2001,88(1).

[2]Roessner A,Haeckel C,Wolf H.Inducible nitric oxide synthase expression in human urinary bladder cancer.[J].Virchows Archiv:an international journal of pathology,2000,437(6).

[3]Theo Klotz M.D.,Wilhelm Bloch M.D.,Christoph Volberg M.D.,et al.Selective expression of inducible nitric oxide synthase in human prostate carcinoma[J].Cancer,1998,82(10).1897-1903.

[4]Morris HR,Hay RT,Matthews JR,et al.Inhibition of Nf-Kappa-B Dna Binding by Nitric Oxide[J].Nucleic Acids Research,1996,24(12).

[5]张瑞.雷公藤内酯醇对小鼠前列腺癌作用及其机制的研究[D].黑龙江中医药大学,2007.