巧克力血琼脂培养基基础的应用

背景^[1-3]

巧克力血琼脂培养基基础用于奈瑟球菌、流感嗜血杆菌的培养，需添5%~10%加脱纤维羊血(无菌脱纤维绵羊血)。奈瑟菌属（Neisseria）是一群革兰染色阴性双球菌，是β-变形菌类的一属无芽孢，无鞭毛，有菌毛，专性需氧，氧化酶阳性。奈瑟菌呈球形，成对排列，形似咖啡豆的革兰阴性球菌，通常位于中性粒细胞内，而在慢性淋病时常位于细胞外，新分离株有荚膜和菌毛。奈瑟球菌是人类淋病的病原菌。主要引起人类泌尿生殖系统粘膜的急性或慢性化脓性感染，是我国流行的发病率最高的性传播疾病。

巧克力血琼脂培养基基础

奈瑟球菌菌体较小，直径为0.6～1.0微米的肾形球菌，常成双排列。无芽胞，无鞭毛，少数有荚膜。需氧或兼性厌氧，发酸能力弱，有氧化酶，不形成吲哚，不还原硝酸盐。DNA中的G+C克分子含量为47～52%，寄生于哺乳动物的粘膜上。

流感嗜血杆菌是一种没有运动力的革兰氏阴性杆菌。它是于1892年由费佛博士在流行性感冒的瘟疫中发现。它一般都是好氧生物，但可以成长为兼性厌氧生物。

流感嗜血杆菌最初被误认为是流行性感冒的病因，但直至1933年，当发现流行性感冒的病毒性病原后，才消除了这种误解。不过，流感嗜血杆菌仍会导致其他不同种类的病症。

配制方法：称取本品43克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，121℃高压灭菌15分钟，于90℃左右，加入5-10%无菌脱纤维羊血，摇匀，继续加热保温，边加热边摇动，直至分层，冷至50℃左右，摇匀，倾注平板。

成分(g/L)：蛋白胨15.0g；酵母浸粉4.0g；；氯化钠5.0g；牛肉浸粉4.0g；琼脂15.0g；PH值:7.2±0.2，25℃。

应用^[4][5]

用于副猪嗜血杆菌Ⅳ型菌毛的初步研究及pilA突变株的筛选研究

克隆并分析了菌毛操纵子的序列参照HPS SH0165全基因组序列,设计引物并克隆Ⅳ型菌毛操纵子序列,通过序列分析发现操纵子的结构基因由四个ORF组成,分别为pilA、pilB、pilC和pilD,分别编码170、462、399和222个氨基酸,通过基因序列分析发现,HPS17株标准菌株中pilA的序列同源性在85%以上,而且基因的保守性较高,而标准菌株pilB、pilC和pilD的序列同源性均在40%-50%左右。

对其蛋白序列进行比对分析,发现pilA基因与相近种属的有关基因相似性较高。另外,PilA蛋白羧基端拥有相对保守的半胱氨酸残基,该位点能够形成二硫键并产生一个环形结构,在Ⅳ型菌毛发挥功能时起到重要作用,而且是主要的抗原决定部位。

PilA蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备以SH0165菌株的基因组DNA为模板,设计引物扩增pilA片段,将pilA与pET-28a连接转化E.coli/BL21（DE3）菌株并进行原核表达。利用透析的方法对表达在包涵体中的PilA蛋白进行纯化,利用纯化好的蛋白免疫BALB/c鼠进行多克隆抗体的制备。间接ELISA和Western-blot分析表明抗体特异性良好,其中较高的效价为1：51200,可用于后续研究使用。

菌毛在不同环境下的表达情况本研究尝试使用多种培养基来实现菌毛的体外表达,如使用LB培养基、巧克力琼脂培养基、鲜血琼脂培养基以及化学成分限定培养基来培养HPS,但通过电镜观察均未观察到菌毛的存在。使用细胞与细菌共培养的方法,试图诱导HPS菌毛的表达,未能达到预期结果。另外,将HPS在鸡胚绒毛尿囊膜上传代后进行细菌的电镜观察,也未能观察到菌毛的存在。用副猪嗜血杆菌感染健康猪,采集感染猪血清及各发病组织,从胸水中分离的细菌通过电子显微镜,观察到了菌毛结构的存在。

参考文献

[1]Bacterial Pili exploit integrin machinery to promote immune activation and efficient blood-brain barrier penetration.[J].Banerjee Anirban,Kim Brandon J,Carmona Ellese M,Cutting Andrew S,Gurney Michael A,Carlos Chris,Feuer Ralph,Prasadarao Nemani V,Doran Kelly S.Nature communications.2011(1)

[2]Identification and analysis of potential virulence-associated genes in Haemophilus parasuis based on genomic subtraction[J].Xiangru Wang,Xiaojuan Xu,Shu Zhang,Fengjuan Guo,Xuwang Cai,Huanchun Chen.Microbial Pathogenesis.2011

[3]Identification of novel immunogenic proteins in pathogenic Haemophilus parasuis based on genome sequence analysis[J].Minhee Hong,Jungoh Ahn,Sungsik Yoo,Jiyeon Hong,Eungyu Lee,Injoong Yoon,Joon-ki Jung,Hongweon Lee.Veterinary Microbiology.2010(1)

[4]Cellular and molecular biology of Neisseria meningitidis colonization and invasive disease.[J].Hill Darryl J,Griffiths Natalie J,Borodina Elena,Virji Mumtaz.Clinical science（London,England:1979）.2010(9)

[5]郭凤娟.副猪嗜血杆菌Ⅳ型菌毛的初步研究及pilA突变株的筛选[D].华中农业大学,2012.