抗体清除液(酸性)的应用

背景^[1-3]

抗体清除液(酸性)用于Western Blot中转移了蛋白的膜的重复利用。在Western中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测其它蛋白，通过使用抗体清除液，充分去除结合的一抗二抗，可以非常方便地重新利用使用过的膜检测其它蛋白。和重新跑一个SDS-PAGE胶相比，不仅省时省力，而且可以消除重新上样而带来的误差，使可比性更强。Westernblot法即是一种将电泳与KIJSA结合起来的技术，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定方法。。将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶上通过电转移到一张合适的印迹膜上，随后用和灵敏检测系统相偶联的抗体来识别结合在膜上的一种或几种蛋白质。

Western Blot抗体清除缓冲液，经过多个抗体的检测试验，通常可以重复利用膜3-5次。酸性抗体清除液适用于NC膜和PVDF膜上的抗体清除。

抗体清除液(酸性)

使用说明：

1.在完成Western化学发光检测后，蒸馏水中漂洗5分钟。

2.弃蒸馏水，加入适量的Western一抗二抗去除液(酸性)，至少需把膜完全覆盖。在摇床上漂洗30-60分钟。

3.弃Western抗体清除液,并吸尽残余液体。加入TBS、TBST或PBS漂洗3-4次，每次在摇床上漂洗3-5分钟。

4.进行封闭(blocking)等Western的后续操作。

注意事项

1.如多次重复使用同一张膜5次以上，有可能会导致蛋白信号的减弱，建议膜重复使用不超过5次。

2.使用ECL等类似的化学发光试剂进行的Western Blot检测适用本试剂。使用非化学发光试剂进行的Western Blot

检测，例如DAB，NBT/BCIP等，不适用于本试剂。

3.Western Blot抗体清除缓冲液有轻微腐蚀性，使用时请注意防护。

4.使用辣根过氧化物酶(HRP)，任何一次封闭(blocking)都应当使用5%脱脂牛奶，如果使用碱性磷酸酯酶，任何一次封闭都应当使用酪蛋白(casein)。

应用^[4][5]

用于SIRT1在细胞应激反应中的作用及其机制研究

SILAC-蛋白组学分析：一组Hela细胞用含有15N标记的精氨酸的SILAC DMEM培养基培养6代,另一组Hela细胞用一般DMEN培养,转染SIRT1-Flag质粒,两组按等细胞数混合,提取蛋白后,应用抗Flag的抗体进行免疫沉淀纯化,最后质谱鉴定,以筛选出Hela细胞中所有与SIRT1相结合的蛋白。

免疫共沉淀：Hela细胞转染SIRT1-Flag质粒,提取蛋白,免疫共沉淀法检测外源性的SIRT1与NPM是否结合。Hela细胞转染pEGFP质粒（对照）,H363Y质粒（无活性SIRT1）和SIRT1质粒（野生型）,加用ACTD刺激24小时后提取蛋白,免疫共沉淀法检测NPM的乙酰化是否改变。Hela细胞提取蛋白,免疫共沉淀法检测内源性NPM与SIRT1是否结合。

Western Blot:Hela细胞转染pEGFP质粒（对照）,H363Y质粒（无活性SIRT1）和SIRT1质粒（野生型）,加用ACTD刺激24小时后提取蛋白,检测NPM,标签Flag,AC-lysine,β-Actin蛋白表达。Hela细胞EX-527处理24小时后,后提取蛋白,检测NPM,AC-lysine,β-Actin蛋白表达。免疫荧光法观察SIRT1在Hela细胞中的分布,检测SIRT1与核仁蛋白NPM是否共定位。

为了研究SIRT1抑制核仁应激的作用是否依赖于它去乙酰化酶的活性,本研究采用了三种方法改变SIRT1的活性：应用SIRT1激活剂Resveratrol（以Resveratrol的溶剂DMSO为对照）预处理2小时,来增加SIRT1的活性；应用SIRT1抑制剂EX-527（以EX-527的溶剂DMSO为对照）预处理2小时,来抑制SIRT1的活性；转染无SIRT1活性的质粒H363Y来过表达没有活性的SIRT1（以转染pEGFP质粒为对照）,然后用ACTD刺激细胞,免疫荧光方法检测细胞核仁的变化。