昆虫细胞的应用

背景^[1-3]

昆虫细胞是提取来自昆虫的一类真核细胞。通过培养制造宿主的病毒，这些病毒可以引起昆虫流行病，但对人畜和植物无害，因而可作病毒杀虫剂。还可以生产某些药用蛋白。

昆虫细胞的体外培养日益受到人们的重视。其原因有两个方面：，作为宿主表达高度特异性的病毒，这些病毒可以引起昆虫流行病，但对人畜和植物无害，因而可作病毒杀虫剂。第二，昆虫多角体病毒可以高水平表达蛋白，其基因片段可以用来构建重组病毒以高效表达外源基因，生产某些药用蛋白。

昆虫细胞

因此昆虫细胞的体外培养正逐渐成为生产用于农业和人类健康保健用的生物产品的重要手段。

细胞系绝大多数来自于鳞翅目和双翅目的农业害虫，其来源组织包括卵巢、精巢、胚胎、成虫盘、血细胞、中肠、脂肪体等，其中用卵巢组织和胚胎组织建立的细胞系最多，而神经组织、表皮组织、内分泌系统和肌肉组织等的细胞系极少或没有报道。用未成熟或未分化的组织建立细胞系比用成熟组织容易，主要是因为其中干细胞含量高。

虽然已建立了很多的昆虫细胞系，但迄今为止，研究和应用的最多的是草地贪叶蛾（Spodoptera Frugiperda）卵巢细胞系Sf21及其克隆株Sf9和粉纹夜蛾（Trichop lusiani）胚胎细胞系BTI-Tn5B1-4（商品名High Five）

应用^[4][5]

用于应用昆虫细胞表达预防性人乳头瘤病毒疫苗和应用填充床生物反应器表达H1N1流感病毒疫苗的研究

以HPV6L1为例，研究了昆虫细胞体系的VLP疫苗生产工艺研究。首先比较不同接毒量、感染密度、细胞收获时间对HPV6L1蛋白表达量的影响。对比不同原理生物反应器培养昆虫细胞的区别，发现WAVE生物反应器更适合悬浮培养昆虫细胞。为了考察不同裂解方法对sf9昆虫细胞裂解的影响，结果表明与超声法、化学裂解法相比，低渗裂解法更适合于昆虫细胞裂解。

又比较不同孔径的中空纤维微滤膜对sf9昆虫细胞收获的影响，选择了GE公司面积为420cm2的三种孔径微滤膜（0.10,0.22,和0.45μm），结果表明，与0.10,0.22μm中空纤维微滤膜相比，孔径为0.45μm中空纤维微滤膜具有更大的平均膜孔径，滤膜阻力较小，有利于培养基的透过，浓缩过程中可以缓解引起的膜表面凝胶层，因此具有更快的处理速度，其平均透过通量可达90L/hm2。

在此基础上结合细胞破碎相关的实验结果，设计应用中空纤维系统作为一个整合系统，实现细胞收获液的浓缩、洗滤、抽提、澄清步骤。此工艺避免了离心机，死端过滤等实验步骤，而且在抽提过程中，采用低渗的方法裂解昆虫细胞，释放目的蛋白，避免了裂解剂（Triton X-100）的加入和超声仪的使用，使整个操作都处于密闭和无菌状态，更适合于工业化生产。

在柱层析初级分离纯化阶段，选择DMAE弱阴离子层析纯化HPV6L1蛋白，与Q Sepharose XL强阴离子层析相比，DMAE弱阴离子层析纯化的HPV6L1蛋白纯度更高，基本达到初级分离纯化的要求。

之后在柱层析精制分离纯化阶段尝试了应用Octyl Sepherose FF、Butyl-S Sepherose FF、Fractogel EMDTMAE、CM Sepherose FF等层析介质进行精纯工艺摸索。考虑到初级分离纯化阶段采用的是阴离子交换层析，不同阶段采用不同原理的层析介质纯化蛋白更有效。

因此在精制分离纯化阶段，选择Octyl Sepherose FF疏水层析纯化HPV6L1蛋白。又摸索了类病毒颗粒体外组装工艺，经解组装、重组装步骤后，获得了均一稳定的病毒样颗粒。对于上述优化的放大纯化工艺所制备的HPV6L1VLPs，进行了SF9细胞宿主DNA残留量；SF9昆虫细胞宿主蛋白残留量；HPV VLP疫苗抗原含量；内毒素等检测。