检定培养基的应用

背景^[1-3]

检定培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。

检定培养基指一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找到目的菌菌落的培养基。

检定培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊的化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来。

检定培养基

几种细菌由于对培养基中某一成分的分解能力不同,其菌落通过指示剂显示不同的颜色而被区分开,这种起鉴别和区分不同细菌作用的培养基,叫检定培养基。

一类只须凭肉眼辨别颜色等鲜明特征就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。

其作用原理主要是在培养基中含有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂。最常见的如伊红美蓝培养基(EMB)，它在饮用水、牛奶、饮料和食品等的大肠菌群数检测以及在大肠埃希氏菌的遗传学等研究工作中，有着重要的应用。改良后的EMB培养基成分是(%)：蛋白胨1，乳糖0.5，蔗糖0.5，伊红Y0.04，美蓝0.0065；最终pH=7.2。

应用^[4][5]

用于恩拉霉素生产菌的选育及其发酵条件优化研究

恩拉霉素（enramycin）是放线菌（Streptomyces fungicidious）分泌的,由不饱和脂肪酸与十几种氨基酸结合的多肽类抗生素。主要成分为恩拉霉素A和恩拉霉素B,还含有少量的恩拉霉素C和D。恩拉霉素对革兰氏阳性菌有良好的抗菌作用,通过抑制其细胞壁前聚物质的合成来影响生物体,特别是对肠内的有害梭状芽孢杆菌（Clostridium）抑制力很强。因其能起到良好的促生长作用,目前作为饲料添加剂使用于畜禽养殖业。

对Streptomyces fungicidious KS010菌株发酵产恩拉霉素进行了初步研究,主要包括恩拉霉素测定方法的建立、高产恩拉霉素菌株的选育、恩拉霉素发酵条件的优化及上罐培养等内容。

首先优化了恩拉霉素的微生物检定法和高效液相色谱法的检定条件,建立了测定恩拉霉素的微生物检定法和高效液相色谱法（HPLC）标准曲线。通过浸提溶液组成、浸提时间、检定菌浓度考察,优化了微生物检定法的检定条件。

在检定条件为丙酮浸提液B（丙酮：2mo1/L盐酸：水=20：1：21）、浸提时间80min、检定菌浓度106个/mL的情况下,建立恩拉霉素微生物检定法标准曲线。恩拉霉素浓度在0.56-35.79U/mL之间,其浓度的对数值与相应的抑菌圈直径呈直线相关；回归方程为Y=0.2436X-3.47436,相关系数r为0.9960。通过流动相配比、流速和浸提时间的考察,优化了HPLC的检定条件。

在色谱条件为检测波长267nm,流动相为乙腈：50mM KH2PO4（30:70）,流速为0.8mL/min的情况下,建立恩拉霉素HPLC标准曲线。恩拉霉素浓度在0.26-275.72U/mL范围内,得到的回归方程Y=1.83099E-6X-0.52846,相关系数r为0.99947。采用同种样品,对两种测定方法进行比较,所得结果重复性好,准确性高,都可用于含恩拉霉素的样品测定。

对出发菌株（Streptomyces fungicidious KS010）进行NTG诱变、通过琼脂块法进行初筛,获得M-19菌株,产量较出发菌株提高32.62%。接着以该菌株为研究对象,比较了紫外复合诱变和60Co-Y复合诱变的效果,结果表明60Co-γ复合诱变优于紫外复合诱变。

从60Co-γ复合诱变正变株中获得一株摇瓶效价达1853U/mL,较出发菌株提高68.00%的菌株。通过继代培养,该菌株稳定性好,命名为Streptomyces fungicidious Co250-42。通过单因素试验和中心组合响应面优化分析考察了影响Streptomyces fungicidious KS010菌株产恩拉霉素的因素,得到液态发酵产恩拉霉素的条件。