BCA法蛋白定量试剂盒的应用

背景^[1-3]

BCA法蛋白定量试剂盒是进行蛋白质浓度测定的最常见的方法之一。

BCA蛋白定量的主要原理是：蛋白质在碱性条件下，可以将二价Cu2+离子还原成一价Cu+离子。产生的一价Cu+离子可以与BCA（Bicinchoninic acid）试剂结合，最终生成紫色的复合物。该复合物在562 nm处有很强的吸收峰。复合物的多少与蛋白质的浓度呈接近的线性关系。

BCA法蛋白定量试剂盒

使用方法:

1.BCA工作液的配制

（1）BCA工作液总体积的计算：

BCA工作液总体积=（标准品数量+待测样品数量+1）×重复数×200μL。

（2）BCA工作液的配制：按50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1），充分混匀。

2.BSA标准品的配制

将BSA标准品做系列稀释，分别得到如下9个不同浓度的标准品：2000μg/mL，1500μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，0μg/mL。

3.取BSA标准品和待测样品各25μL到96孔板孔内，

4.往每孔中加入200μL的BCA工作液，盖上96孔板盖子。

5.将96孔板放37℃，30分钟。

6.用酶标仪测562 nm处的光吸收值。

7.根据BSA标准品的光吸收值（扣除空白孔的光吸收值即为最终的读数），绘制标准曲线。依据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。

应用^[4][5]

用于Raf激酶抑制蛋白对HCCLM3肝癌细胞乙酰肝素酶表达的抑制作用及其机制研究

以HCCLM3肝癌细胞、空载体转染的HCCLM3肝癌细胞和稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞为研究对象，检测肝癌细胞中RKIP、Hpa、P-ERK的表达情况，进一步明确RKIP抑制肝癌细胞Hpa的表达是否与Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路有关。

方法：1、空载体转染的HCCLM3肝癌细胞、稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞，提取细胞蛋白，BCA法蛋白定量。Westernbloting检测RKIP、P-ERK和Hpa蛋白表达，观察P-ERK、Hpa的表达是否与RKIP的表达有关。

2、HCCLM3肝癌细胞、经稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞，提取细胞蛋白，BCA法蛋白定量。Westernbloting检测RKIP、P-ERK和Hpa蛋白表达，观察RKIP抑制肝癌细胞Hpa的表达是否与Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路有关。

3、HCCLM3肝癌细胞、经稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞加入EGF，激活ERK通路，15分钟后提取细胞蛋白，BCA法蛋白定量。Westernbloting检测RKIP、P-ERK和Hpa蛋白表达，进一步验证RKIP抑制肝癌细胞Hpa的表达与抑制Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路活化有关。

结果：1、RKIP转染组HCCLM3细胞中RKIP的表达明显高于空载体转染组（P<0.05），而P-ERK和Hpa的表达明显低于空载体转染组（P<0.05）；随着HCCLM3细胞中RKIP的表达升高，P-ERK、Hpa的表达下降。

2、RKIP转染组HCCLM3细胞中RKIP的表达明显高于空白对照组（P<0.05），而P-ERK和Hpa的表达明显低于空白对照组（P<0.05）；随着HCCLM3细胞中RKIP的表达升高，P-ERK、Hpa的表达下降。

3、EGF（+）对照组HCCLM3细胞中P-ERK的表达明显高于EGF（+）RKIP转染组（P<0.05），EGF（+）对照组HCCLM3细胞中Hpa的表达明显高于EGF（+）RKIP转染组（P<0.05）；随着HCCLM3细胞中RKIP的表达升高，ERK通路激活后，P-ERK、Hpa的表达仍下降。

参考文献

[1]Specificity protein 1 regulates fascin expression in esophageal squamous cell carcinoma as the result of the epidermal growth factor/extracellular signal-regulated kinase signaling pathway activation[J].Xiao-Feng Lu,En-Min Li,Ze-Peng Du,Jian-Jun Xie,Zhang-Yan Guo,Shu-Ying Gao,Lian-Di Liao,Zhong-Ying Shen,Dong Xie,Li-Yan Xu.Cellular and Molecular Life Sciences.2010(19)

[2]Acetaldehyde induces matrix metalloproteinase-9 gene expression via nuclear factor-κB and activator protein 1 signaling pathways in human hepatocellular carcinoma cells:Association with the invasive potential[J].Chien-Yun Hsiang,Shih-Lu Wu,Jaw-Chyun Chen,Hsin-Yi Lo,Chia-Cheng Li,Su-Yin Chiang,Hsiu-Ching Wu,Tin-Yun Ho.Toxicology Letters.2007(1)

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[4]Raf Kinase Inhibitory Protein Regulates Aurora B Kinase and the Spindle Checkpoint[J].Eva M.Eves,Paul Shapiro,Karuna Naik,Ulf R.Klein,Nicholas Trakul,Marsha Rich Rosner.Molecular Cell.2006(4)

[5]冯宁宁.Raf激酶抑制蛋白对HCCLM3肝癌细胞乙酰肝素酶表达的抑制作用及其机制[D].河北医科大学,2012.