人乳酸脱氢酶(LDH)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人乳酸脱氢酶(LDH)ELISA KIT可以特异性检测样本中人乳酸脱氢酶(LDH)的含量，主要用于人乳酸脱氢酶(LDH)的体外定性及定量实验。

原理：用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

人乳酸脱氢酶(LDH)ELISA KIT

操作步骤：

1.从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

3.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

4.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

5.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于乳酸脱氢酶的克隆表达及酶学性质的研究

苯乳酸（phenyllactic acid,PLA）是一种新型生物防腐剂,乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）是乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB）中转化苯丙酮酸（phenypyruvate,PPA）生成苯乳酸的主要酶。根据已知的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）WCFS1全基因组序列可知,植物乳杆菌有三个乳酸脱氢酶基因,分别为ldhL1、ldhL2、ldhD,三个基因的酶产物分别为:L1-乳酸脱氢酶（L1-LDH,EC:1.1.1.27）、L2-乳酸脱氢酶（L1-LDH,EC:1.1.1.27）和D-乳酸脱氢酶（D-LDH,EC:1.1.1.28）。

研究根据L.plantarum WCFS1的三个乳酸脱氢酶基因设计引物,并以植物乳杆菌SK002全基因组DNA为模版,PCR扩增并连接到pMD-19简易T载体。测序结果表明:植物乳杆菌SK002 ldhL1（Gene bank登录号FJ712707）基因长度为963 bp;ldhD（Gene bank登录号FJ712706）基因长度为999 bp;ldhL2（Gene bank登录号为FJ392647）基因长度为930 bp。

将三个基因连入表达载体,并导入大肠杆菌BL21（DE3）中,成功诱导表达并纯化出三种重组乳酸脱氢酶。三种酶的蛋白分子量分别为35、34、40 kDa。测定三种重组酶对底物苯丙酮酸的活性,发现:L2-LDH对苯丙酮酸的比活力仅为0.06 U/mg;L1-LDH为71.06 U/mg,是L2-LDH的1000多倍;D-LDH比活力为215.84 U/mg。故重点研究L1-LDH和D-LDH的酶学性质。

L1-LDH酶活测定的最适pH为6.0,温度为40℃;D-LDH最适pH为6.0,温度为30℃;L1-LDH的pH稳定性及热稳定性均好于D-LDH。在各自的最适测定酶活条件下,测定两种酶对丙酮酸及苯丙酮酸的Km。L1-LDH对丙酮酸及苯丙酮酸Km分别为0.23、3.96 mM;D-LDH对丙酮酸及苯丙酮酸Km分别为0.06、5.4 mM。

参考文献

[1]Biotransformation of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by growing and resting cells of a Lactobacillus sp.[J].Xingfeng Li,Bo Jiang,Beilei Pan.Biotechnology Letters.2007(4)

[2]Molecular cloning and characterization of a novel lactate dehydrogenase gene from Clonorchis sinensis[J].Guang Yang,Chunxia Jing,Peixian Zhu,Xuchu Hu,Jin Xu,Zhongdao Wu,Xinbing Yu.Parasitology Research.2006(1)

[3]Metabolic engineering of a Lactobacillus plantarum double ldh knockout strain for enhanced ethanol production[J].Siqing Liu,Nancy N.Nichols,Bruce S.Dien,Michael A.Cotta.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.2006(1)

[4]Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria:an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation[J].Francesca Valerio,Paola Lavermicocca,Michelangelo Pascale,Angelo Visconti.FEMS Microbiology Letters.2004(2)

[5]贾江花.乳酸脱氢酶的克隆表达及酶学性质的研究[D].江南大学,2009.