粘杆菌素的分离方法和检测方法

背景及概述^[1]

粘杆菌素(colistin，CLS)，又称多粘菌素E(polymyxinE)，由多个粘杆菌素(B.polymyxa)产生。它对革兰氏阴性菌有很强的抑制作用，可治疗志贺氏痢疾杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏杆菌和普通变形杆菌引起的感染，它还可以用作饲料添加剂，提高饲料转化率，促进畜禽生长，预防规模化养殖中畜禽疾病的发生。因硫酸粘杆菌素具有抗菌作用强、残留量低、不易产生耐药性的特点，因此，中国、美国、欧盟和日本等许多国家和地区批准将其作为饲料添加剂或兽药。

分离方法^[1]

粘杆菌素发酵液50m3，发酵液效价为745283u/ml，加入饮用水，发酵液的粘度稀释至497Pa.s；温度降温至0℃，加入10%的草酸溶液，调节pH至2.1；加入250kg氨甲基聚苯乙烯絮凝剂，搅拌20min并过滤，得到滤液54m3，发酵液效价为677655u/ml，预处理收率为98.2%。

经降膜浓缩，粘杆菌素滤液体积为16.5m3，滤液效价为2213344u/ml。

启动高速离心分离机进行二级逆流萃取，萃取过程中，粘杆菌素溶液和溶媒的温度控制在0～10℃，有机溶媒醋酸丁酯和丁醇（其中丁醇占10%）的混合物体积为82.5m3。一级萃取pH控制在8～9，二级萃取pH控制在9～10，滤液的流速为1m3/h，有机溶媒的流量为3.51m3/h。萃取结束，萃取液的效价为441551u/ml，萃取液的体积为81.3m3，萃取收率为98.1%，萃余液的效价为724u/ml。

将DEAE高流速琼脂糖微球装入玻璃柱中，加入量为2.43吨，并且径高比为5∶1。层析前，萃取液的温度控制在0～10℃；每次萃取液上样量为填充剂总量的20～30%；层析结束，洗脱剂醋酸丁酯用量为32.8m3，收集粘杆菌素A溶液68m3，粘杆菌素B溶液45m3。

分别对粘杆菌素A和B溶液进行反萃取。反萃取过程中，温度控制在0～5℃；一级控制pH值3.5；二级控制pH值2.0，硫酸的浓度为3.6%。反萃取结束，粘杆菌素A废醋酸丁酯效价为482μ/ml，粘杆菌素B废醋酸丁酯效价为473μ/ml。硫酸粘杆菌素A溶液体积为46.5m3，粘杆菌素B溶液体积为24m3。

分别对粘杆菌素A和B溶液进行喷雾干燥，收集硫酸粘杆菌素A和硫酸粘杆菌素B，其中硫酸粘杆菌素A含量为97.3%，硫酸粘杆菌素B含量为97.1%。粘杆菌素总提取收率为88.2%。

检测方法^[1]

用试剂盒检测动物组织(如猪肌肉、鸡肝脏、鱼、虾等)中的粘杆菌素。

1、样品前处理

取1g动物组织匀浆物，加入10ml0.05M硫酸溶液，用涡旋仪涡动5min，置于37℃温箱孵育30min，3000g以上10℃离心10min，取上层液4ml，加入160ml2M氢氧化钠溶液，用涡旋仪涡动30s，调pH为中性，移取液体500μl，加入500μl复溶液，用涡旋仪涡动30s，充分混匀，取样进行分析。样品的前处理主要是为了更精密的提取样品中的目标物，从而用于后续的检测。

2、用试剂盒检测

向包被有粘杆菌素偶联抗原的酶标板微孔中加入粘杆菌素标准品溶液或样本溶液50μl，加入粘杆菌素特异性抗体工作液50μl，用盖板膜封板，25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干，每孔加入250μl洗涤液，10秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干，再加入粘杆菌素酶标抗抗体工作液100μl，用盖板膜封板，25℃避光环境中反应30min，将孔内液体甩干，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲和底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)各50μl，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，25℃避光环境中反应30min，每孔加入2mol/L终止液硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

3、检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。

公式中B为标准品溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0为0μg/L标准品溶液的平均吸光度值。

以粘杆菌素标准品浓度(μg/L)值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图(图1)。用同样的方法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出粘杆菌素的残留量。本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需1小时可以完成。

菌渣后处理方法^[3]

一种粘杆菌素发酵菌渣的循环无害化处理方法，其特征在于：包括如下步骤：

a.将粘杆菌素发酵菌渣添加有机氮源和有机碳源的混合物后经混匀，压榨得到菌渣预混物；

b.将步骤a中的菌渣预混物进行固态发酵；

c.将步骤b中的菌渣固态发酵产物经85-95℃烘干、粉碎、过60目筛后，获得菌渣粉末；

d.将步骤c得到的菌渣粉末替代粘杆菌素发酵培养基中25-45％的豆粕粉进行再利用。

本方法通过前期添加预混物，改变了菌渣的物理特性，又通过生物转化的方法将菌渣转化成无公害、可再次利用的原材料替代了部分发酵原材料，在降低生产成本的同时，还减少了废渣的排放。整个方法工艺简单，操作方便，是一种处理杆菌类抗生素发酵废渣的有效方式。

参考文献

[1][中国发明,中国发明授权]CN200810118443.5一种检测粘杆菌素的方法及其专用酶联免疫试剂盒

[2][中国发明,中国发明授权]CN201410432706.5一种从粘杆菌素发酵液中分离粘杆菌素A和粘杆菌素B的方法

[3][中国发明]CN201510476857.5一种粘杆菌素发酵菌渣的循环无害化处理方法