人蛋白C(PROTEIN C)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人蛋白C(PROTEIN C)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中人蛋白C(PROTEIN C)水平。

实验原理：用纯化的人蛋白C(PROTEIN C)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人蛋白C(PROTEIN C)，再与HRP标记的人蛋白C(PROTEIN C)形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人蛋白C(PROTEIN C)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人蛋白C(PROTEIN C)浓度。

人蛋白C(PROTEIN C)ELISA KIT

操作步骤

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

用于人蛋白C的研制及其相关研究

研究包括：1物理化学方法纯化人血浆蛋白C：将3000ml新鲜冷冻血浆为起始材料，以DEAE-Sephadex A 50为吸附介质，收集洗脱产物，再经DEAE-Sepharose FF及肝素-Sepharose CL 6B层析，对收集产物进行APTT、SDS-PAGE及Western blotting检测，获得纯度大于95％的人血浆蛋白C。

2人蛋白C cDNA在CHO-dhfr细胞中的表达：利用脂质体转染技术将含有人蛋白C cDNA基因和二氢叶酸还原酶基因的载体转入CHO细胞中，经过MTX中文摘要博士学位论文（6.4umol/L）抗性筛选，APTT、SDS一PAGE及westem blotting检测获得了6株高表达的细胞株。

3人蛋白C单克隆抗体的制备与鉴定:利用人血浆蛋白C纯化产物免疫BALB/C小鼠制备了5株人蛋白C单克隆抗体细胞株，分别进行了效价、亚类、特异性及亲和力等鉴定。

4人蛋白C单克隆抗体的初步应用l)酶联免疫分析法检测人血浆蛋白C:利用两株识别不同人蛋白C位点的单克隆抗体细胞株建立了夹心ELISA检测人血浆蛋白C。

此方法可用于检测血浆中3.12ZO0ng/mL范围内蛋白C，实验可在4小时内完成，实验的批内和批间变异不超过7%，测得102份正常血浆样品的参考范围是4.02士0.295林留mL 2)亲合层析法纯化人血浆蛋白C:先用DEAE一S叩hadexA一50吸附人血浆，然后将吸附产物过人蛋白C单克隆抗体与澳化氢活化的SePharose 4B偶联制备亲和层析柱，获得人蛋白C的纯化产物。

参考文献

[1]Recombinant Human Protein C Expression in the Milk of Transgenic Pigs and the Effect on Endogenous Milk Immunoglobulin and Transferrin Levels[J].Kevin E.Van Cott,Henryk Lubon,F.C.Gwazdauskas,James Knight,William N.Drohan,William H.Velander.Transgenic Research.2001(1)

[2]Regulation of human protein C gene expression by the mouse WAP promoter[J].Rekha K.Paleyanda,Da-Wei Zhang,Lothar Hennighausen,Robert A.McKnight,Henryk Lubon.Transgenic Research.1994(6)

[3]Inefficient processing of human protein C in the mouse mammary gland[J].William N.Drohan,Da-Wei Zhang,Rekhak Paleyanda,Rouling Chang,Marie Wroble,William Velander,Henryk Lubon.Transgenic Research.1994(6)

[4]Cytokine profile in patients with severe gram negative sepsis[J].S.Jain,S.Agrawal,V.Dhawan,N.Sharma,S.Varma.International Journal of Infectious Diseases.2010

[5]沈永才.人蛋白C的研制及其相关研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,2004.